沉默Dicer基因?qū)θ松圜[癌細(xì)胞株Tca-8113生物學(xué)行為的影響.pdf

1、舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，近年發(fā)病率呈上升及年輕化的趨勢，目前以手術(shù)為主，放療化療為輔的綜合治療對舌鱗癌患者5年生存率沒有明顯的提高，仍徘徊在50％左右，中晚期患者的5年生存率更低，如何提高舌鱗癌患者的生存率和生存質(zhì)量依然是一個世界性的難題，因此，十分有必要探尋更加安全有效的治療方法來輔助加以破解。目前除了探索舌鱗癌早期發(fā)現(xiàn)的有效手段外，通過基因靶向治療控制舌鱗癌的生長，增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移成為提高舌鱗癌五年生存率的有效策略

2、，必將為最終控制舌鱗癌提供新的方法，因而，也成為當(dāng)今舌鱗癌治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。
　　 Dicer酶是細(xì)胞內(nèi)的重要基因，與細(xì)胞存活和胚胎發(fā)育有關(guān);同時Dicer酶也是核糖核酸內(nèi)切酶-Ⅲ(RNaseⅢ)家族的關(guān)鍵成員，由Dicer基因編碼，是RNA干擾途徑中的關(guān)鍵組分，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，在小干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)的產(chǎn)生過程中起著重要的作用[

3、1-3]，并與其酶切產(chǎn)物siRNAs及miRNAs及其他蛋白復(fù)合物在多種生物過程中起調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲遷移及死亡等等。其中siRNA與RNA干擾有關(guān)，是機(jī)體的一種關(guān)鍵的抗病毒機(jī)制。miRNAs是一類大小約～22nt的保守非編碼RNA，它通過促進(jìn)RNA降解或者抑制翻譯來調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且這些基因在一定意義上作為潛在的癌基因或抑癌基因參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在腫瘤

4、的發(fā)生過程中，當(dāng)miRNAs與癌基因相互作用時，其表達(dá)量下調(diào)，導(dǎo)致癌基因激活;當(dāng)miRNA與抑癌基因相互作用時，其表達(dá)量上調(diào)，導(dǎo)致抑癌基因失活[4-5]。不同的腫瘤中miRNAs的表達(dá)譜改變不同，如部分miRNAs表達(dá)上調(diào)，部分miRNAs表達(dá)下調(diào)，但是，在人類的大部分腫瘤中miRNAs的表達(dá)普遍降低[6]，而這種降低在腫瘤的發(fā)展過程中是起主導(dǎo)作用，還是僅僅反映了腫瘤的未分化狀態(tài)，還不是很清楚。作為miRNAs的加工酶，Dicer酶的在

5、不同的腫瘤中表達(dá)也不同，在某些腫瘤中，Dicer酶表達(dá)下調(diào)，而在另一些腫瘤中，Dicer酶的表達(dá)卻上調(diào)，作為miRNAs的上游調(diào)控器，Dicer表達(dá)的變化可能會通過改變了miRNAs的表達(dá)譜而影響腫瘤的生物學(xué)行為。許多證據(jù)表明這些能夠調(diào)節(jié)miRNA量改變的功能性基因與人類腫瘤的發(fā)生有關(guān):如在肺部的非小細(xì)胞肺癌中miRNA let-7與Ras[7]，在慢性淋巴細(xì)胞白血病中miR-15a、miR-16-1與bcl-2[8];在乳腺的腫瘤中m

6、iR-21與PDCD4和TPM1[9]等。由于Dicer酶既是正常機(jī)體運(yùn)作中的關(guān)鍵基因，其表達(dá)的變化又與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密聯(lián)系，正是Dicer酶這種作用的不確定性[10]，使研究者已把它作為RNA干擾治療的重點(diǎn)進(jìn)行研究。2005年Karub[11]等首次報道Dicer與人類腫瘤的相關(guān)性，他們研究發(fā)現(xiàn)Dicer在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)下調(diào)，并明確其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。之后越來越多的學(xué)者著手研究Dicer酶與腫瘤之間的相關(guān)性，現(xiàn)

7、更有學(xué)者通過體外干擾Dicer基因的表達(dá)以驗證Dicer酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，而在舌鱗癌細(xì)胞中Dicer酶的表達(dá)及其作用尚不清楚。因此，本研究通過體外靶向沉默人舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113細(xì)胞中Dicer基因的表達(dá)，進(jìn)一步觀察細(xì)胞的體外增殖，細(xì)胞周期，粘附、侵襲及遷移等生物學(xué)行為的變化，以探討Dicer酶基因沉默對腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為尋求控制舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展提供新的靶點(diǎn)，并為將來進(jìn)一步的研究提供實(shí)驗基礎(chǔ)。
　　 本研究

8、包括以下三部分:
　　 第一部分、Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義
　　 目的:
　　 探討Dicer在舌鱗癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義。
　　 材料和方法:
　　 1.選取兩株侵襲轉(zhuǎn)移能力不同的舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞，并以正?？谇簧掀ぜ?xì)胞作為對照。
　　 2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)及Westem blot檢測舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞、UM-1細(xì)胞及正常口

9、腔上皮細(xì)胞的Dicer酶的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　 3.應(yīng)用實(shí)時定量RT-PCR檢測Tca-8113細(xì)胞、UM-1細(xì)胞及正?？谇簧掀ぜ?xì)胞的Dicer酶的mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色法表明，Dicer酶在正常口腔上皮細(xì)胞胞漿中的染色最深，在UM-1細(xì)胞胞漿中的染色最淺;Westem blot分析表明Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平較正常口

10、腔上皮細(xì)胞明顯下降(P＜0.05)，其中UM-1的Dicer酶蛋白質(zhì)表達(dá)水平又較Tca-8113下降(P＜0.05)。
　　 2.實(shí)時定量RT-PCR進(jìn)一步在mRNA水平上證實(shí)了Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中的表達(dá)較正?？谇簧掀ぜ?xì)胞下降(P＜0.05)，而兩株舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中的Dicer酶mRNA水平無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 小結(jié):
　　

11、 1.Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平與正?？谇簧掀ぜ?xì)胞相比表達(dá)下調(diào)。
　　 2.Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中的mRNA水平與正?？谇簧掀ぜ?xì)胞相比表達(dá)下調(diào)。
　　 第二部分、舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染Dicer-siRNA及干擾率檢測
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建沉默Dicer基因的細(xì)胞模型，將Dicer-siRNA體

12、外轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113細(xì)胞，并觀察轉(zhuǎn)染率及檢測干擾率。
　　 2.為沉默Dicer基因后檢測舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113細(xì)胞生物學(xué)行為變化的實(shí)驗做準(zhǔn)備。
　　 材料和方法:
　　 1.根據(jù)前期結(jié)果，以舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞作為實(shí)驗對象，構(gòu)建沉默Dicer基因的細(xì)胞模型，確定分組，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法，用Lipofectamine(R)RNAiMAX將小干擾片段Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染入Tca-81

13、13細(xì)胞，采用熒光倒置顯微鏡觀察熒光FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.實(shí)時定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞中Dicer酶的mRNA表達(dá)變化。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Westem blot分析轉(zhuǎn)染后Tca-8113細(xì)胞中Dicer酶的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.熒光倒置顯微鏡鏡下觀察顯示100nM濃度的FAM標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染情況良好。
　　 2.實(shí)時定量

14、RT-PCR測顯示，實(shí)驗組Dicer酶的mRNA水平下調(diào)，抑制率約61.4％，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.免疫細(xì)胞化學(xué)染色可見，轉(zhuǎn)染Dicer-siRNA后，Tca-8113細(xì)胞胞漿中的Dicer蛋白質(zhì)染色與對照組相比明顯變淺;Western blot檢測顯示實(shí)驗組Dicer酶的蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，抑制率約為57.4％，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 小結(jié):
　　

15、 Dicer-siRNA能有效地干擾Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113中的蛋白質(zhì)和mRNA水平的表達(dá)。
　　 第三部分、沉默Dicer基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞株Tca-8113的細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響
　　 目的:
　　 探討Dicer酶在舌鱗癌細(xì)胞Tca-8113增殖、侵襲遷移中的作用。
　　 材料和方法:
　　 1.構(gòu)建沉默Dicer基因的細(xì)胞模型，將Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染舌鱗

16、癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞，同時設(shè)陰性對照組及空白組。
　　 2.沉默Dicer基因后，MTT法檢測Dicer酶對Tca-8113細(xì)胞體外增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測Dicer酶對Tca-8113細(xì)胞的體外細(xì)胞周期的影響。
　　 3.沉默Dicer基因后，粘附實(shí)驗、細(xì)胞劃痕實(shí)驗及Transwell侵襲遷移實(shí)驗檢測Dicer酶對Tca-8113細(xì)胞體外侵襲遷移能力的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法檢

17、測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后24h及48h，實(shí)驗組的細(xì)胞體外增殖活性與對照組相比有顯著差異，即轉(zhuǎn)染Dicer-siRNA后，Tca-8113細(xì)胞的增殖活性與對照組相比明顯升高(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染后72h，Dicer-siRNA效應(yīng)減弱，實(shí)驗組細(xì)胞的增殖活性與對照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果，與對照組相比，轉(zhuǎn)染Dicer-siRNA后， Tca-8113細(xì)胞的G1期縮短，G2期和S期延長，表明體外Dicer基因沉默后，T

18、ca-8113細(xì)胞的細(xì)胞周期向G2期及S期推進(jìn)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.粘附實(shí)驗、細(xì)胞劃痕實(shí)驗及Transwell侵襲遷移實(shí)驗結(jié)果表明，Tca-8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染Dicer-siRNA后，細(xì)胞的體外粘附、侵襲、遷移能力均較對照組有明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 小結(jié):
　　 1.沉默Dicer基因的表達(dá)可促進(jìn)Tca-8113細(xì)胞的體外增殖能力、促使細(xì)胞周期向S期推進(jìn)。<

19、br>　　 2.沉默Dicer基因的表達(dá)可促進(jìn)Tca-8113細(xì)胞的體外侵襲及遷移能力。
　　 全文結(jié)論：
　　 1.本研究選取的兩株舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞和UM-1細(xì)胞中Dicer酶的蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)水平均較正?？谇簧掀ぜ?xì)胞下調(diào)。
　　 2.應(yīng)用小干擾片段Dicer-siRNA可體外有效地干擾Dicer在舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113細(xì)胞中的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平;
　　 3.體外沉默