基于大鼠腹膜間皮細(xì)胞TGF-β-Smad信號途徑研究川芎嗪納米噴霧劑抗實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連作用機(jī)制.pdf

1、目的:外科臨床至今沒有防治術(shù)后腹腔粘連統(tǒng)一而廣泛應(yīng)用的好辦法，預(yù)防腹腔粘連藥物的優(yōu)化及機(jī)理研究一直是外科臨床及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。中醫(yī)藥在防治術(shù)后腹腔粘連方面具有多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)發(fā)揮作用、毒副作用小且價(jià)格低廉的優(yōu)勢，這其中川芎嗪脫穎而出，受到學(xué)者們的關(guān)注。導(dǎo)師及其研究團(tuán)隊(duì)長期以來一直致力于中醫(yī)藥防治術(shù)后腹腔粘連的研究工作，對川芎嗪防治術(shù)后腹腔粘連也進(jìn)行了專項(xiàng)研究，在完成了川芎嗪納米噴霧劑的制備并建立了質(zhì)量監(jiān)控體系后，證實(shí)了川芎嗪納米噴

2、霧劑具有抑制腹腔粘連模型腹腔液中粘連相關(guān)因子TGF-β1、FN、CTGF的升高和調(diào)節(jié)纖溶系統(tǒng)t-PA、PAI平衡的作用。結(jié)合腹膜間皮細(xì)胞在腹腔粘連形成過程中的重要作用及TGF-β這一粘連形成機(jī)制中關(guān)鍵的靶點(diǎn)，我們開展本項(xiàng)研究，旨在進(jìn)一步明確川芎嗪納米噴霧劑藥效的同時(shí)研究其影響腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的機(jī)制，及在TGF-β致組織粘連過程中川芎嗪納米噴霧劑如何調(diào)控TGF-β/Smad信號途徑及下游靶基因的表達(dá)，從而深入川芎嗪納米噴霧劑防治腹腔

3、粘連的作用機(jī)理研究。
　　川芎嗪納米噴霧劑防治大鼠實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連藥效學(xué)研究部分:
　　方法:1、銼刀法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連模型。SD大鼠120只，隨機(jī)分成4組，每組30只。A組空白組:造模后不使用任何藥物，直接關(guān)腹;B組川芎嗪原料組:關(guān)腹前創(chuàng)面涂抹川芎嗪原料溶液，5 ml/kg;C組川芎嗪納米噴霧劑組，關(guān)腹前創(chuàng)面噴涂川芎嗪納米噴霧劑，5 ml/kg;D組透明質(zhì)酸鈉組:關(guān)腹前創(chuàng)面涂抹1％透明質(zhì)酸鈉凝膠，0.5 ml/kg。2

4、、各組分別于術(shù)后1、3、5、7、14d隨機(jī)抽取6只大鼠，處死開腹，根據(jù)Phillips五分級標(biāo)準(zhǔn)、觀察盲腸受損處粘連情況，分別評分記錄。取盲腸受損創(chuàng)面組織進(jìn)行病理檢測和透射電鏡檢測，對腹腔粘連形成過程及川芎嗪納米噴霧劑對不同階段干預(yù)后盲腸受損創(chuàng)面的病理形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:1、從整體層次，能降低大鼠腹腔粘連的發(fā)生率，降低粘連的分級評分;2、從病理形態(tài)學(xué)層次，能明顯抑制盲腸受損創(chuàng)面組織成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織增生;3、從超

5、微結(jié)構(gòu)層次，能改善盲腸受損創(chuàng)面組織間皮細(xì)胞受損后結(jié)構(gòu)的破壞，抑制成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。
　　結(jié)論:川芎嗪納米噴霧劑具有確切的防治大鼠實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連的效果。
　　川芎嗪納米噴霧劑保護(hù)大鼠腹膜間皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　方法:1、胰酶消化法體外培養(yǎng)出大鼠腹膜間皮細(xì)胞(RPMCs)，免疫組化進(jìn)行鑒定;2、MTT法測定川芎嗪納米噴霧劑對正常RPMCs和經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs活性的影響;
　　結(jié)果:1、分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)

6、鑒定為RPMCs;2、川芎嗪納米制劑對正常RPMCs的活性沒有影響，經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs活性顯著性下降，而川芎嗪納米制劑能夠抑制經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs活性下降，對RPMCs有一定的保護(hù)作用;
　　結(jié)論:川芎嗪納米制劑通過抑制受損RPMCs的活性下降而保護(hù)RPMCs。
　　川芎嗪納米噴霧劑調(diào)控大鼠腹膜間皮細(xì)胞TGF-β/Smad信號途徑的實(shí)驗(yàn)研究部分:
　　方法:1、體外培養(yǎng)大鼠腹膜間皮細(xì)胞并鑒定;2、經(jīng)T

7、nf-α誘導(dǎo)RPMCs，激活TGF-β/Smad信號途徑，RT-PCR檢測川芎嗪納米制劑干預(yù)下TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的表達(dá);3、川芎嗪納米制劑干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)p-Smad2/3的定位和蛋白表達(dá)免疫組化分析;4、川芎嗪納米制劑干預(yù)下細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Smad7、FN、CTGF、PAI-1、和COL1的Western blot蛋白分析;
　　結(jié)果:1、分離培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定為RPMCs;2、經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs的

8、TGF-β1mRNA表達(dá)明顯上調(diào)、Smad7mRNA表達(dá)明顯受到抑制，而川芎嗪納米制劑能抑制TGF-β1mRNA的表達(dá)、上調(diào)Smad7mRNA的表達(dá);3、經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs的p-Smad2/3被激活轉(zhuǎn)核內(nèi)聚，表達(dá)水平明顯上調(diào)，而川芎嗪納米制劑能抑制p-Smad2/3的轉(zhuǎn)位及表達(dá)水平;4、經(jīng)Tnf-α誘導(dǎo)的RPMCs的TGF-β1、FN、CTGF、COL1和PAI-1蛋白含量升高，Smad7的蛋白含量減少;川芎嗪納米制劑能降低T

9、GF-β1、FN、CTGF、COL1和PAI-1的蛋白含量，提高Smad7的蛋白含量;
　　結(jié)論:川芎嗪納米制劑能抑制TGF-β/Smad信號途徑的激活，進(jìn)一步抑制其下游靶基因的表達(dá)，從而抑制腹膜纖維化，起到抗腹腔粘連的作用。
　　總結(jié):研究從整體到局部再到微觀三個層次明確了川芎嗪納米噴霧劑防治大鼠實(shí)驗(yàn)性腹腔粘連的效果，證實(shí)了川芎嗪納米噴霧劑對大鼠腹膜間皮細(xì)胞受損時(shí)結(jié)構(gòu)和活性的保護(hù)作用，并明確了川芎嗪納米噴霧劑通過抑制TGF

10、-β1的表達(dá)，進(jìn)而抑制Smad2/3核內(nèi)聚和磷酸化水平，同時(shí)上調(diào)Smad7的表達(dá)，起到抑制TGF-β/Smad信號途徑的作用，進(jìn)一步抑制其下游靶基因FN、CTGF、COL1和PAI-1的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的生成和積聚及膠原的合成和堆積，最終防止腹膜纖維化，發(fā)揮防治腹腔粘連的作用。本研究獲得了川芎嗪納米噴霧劑致術(shù)后纖維化改變的功能依據(jù)，并結(jié)合下游靶基因激動/抑制情況，分析了其與Smad信號通路的關(guān)系及影響的可能機(jī)制，為川芎嗪納米噴霧