核糖體打靶載體電轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞條件的優(yōu)化.pdf

1、目前基因治療的一個(gè)難點(diǎn)就是尋找一個(gè)安全，穩(wěn)定，高效的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和非病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是兩種常用的轉(zhuǎn)染手段。出于安全性方面的考慮，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了核糖體基因區(qū)打靶載體(human ribosomal DNA—targeting vectot)——pHrneo，它是一種人源非病毒載體，可以靶向性地整合到人核糖體基因區(qū)，并且已經(jīng)成功地利用該載體將外源基因人凝血因子Ⅷ導(dǎo)入人纖維肉瘤細(xì)胞(HT1080)中，獲得定點(diǎn)整合細(xì)胞克

2、隆。但是，利用該載體轉(zhuǎn)染正常細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率還是很低。 目的：本課題利用攜帶有綠色熒光蛋白基因(GFP)的核糖體基因區(qū)打靶載體(pHrneo—GFP)電轉(zhuǎn)染成人肝細(xì)胞株(HL7702)，優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染(電轉(zhuǎn)染)的參數(shù)，并且將HL7702細(xì)胞同步化，提高該載體的電轉(zhuǎn)染效率。 方法： 一．優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù)細(xì)胞數(shù)和電轉(zhuǎn)染緩沖液體積；孵育條件；電壓與電容；電轉(zhuǎn)染緩沖液(介質(zhì))是影響電轉(zhuǎn)染效率的幾個(gè)主要參數(shù)。我們?cè)O(shè)計(jì)了多組獨(dú)

3、立實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化上面這些參數(shù)。電轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色得到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率；流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染48小時(shí)后基因表達(dá)效率。優(yōu)化電轉(zhuǎn)染參數(shù)，得到一個(gè)最適合核糖體打靶載體轉(zhuǎn)染成人肝細(xì)胞株(HL7702)的電轉(zhuǎn)染條件。 二．細(xì)胞同步化對(duì)電轉(zhuǎn)染的影響考慮到處于G2/M期的細(xì)胞會(huì)有利于電轉(zhuǎn)染，選擇羥基脲(hydroxyurea)作為HL7702的細(xì)胞同步化藥物，利用它將HL7702細(xì)胞同步在G2/M期，再對(duì)同步化處理細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行電

4、轉(zhuǎn)染，分析細(xì)胞同步在G2/M期對(duì)電轉(zhuǎn)染的影響。 結(jié)果：優(yōu)化四組電轉(zhuǎn)染參數(shù)后，可以得到92.53±2.31％的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活率和26.03±2.40％的GFP基因表達(dá)率。羥基脲可以將60％以上的HL7702細(xì)胞同步在G2/M期，并且得到了90％以上的轉(zhuǎn)染后活率和60％以上的轉(zhuǎn)染后基因表達(dá)率。 結(jié)論：本課題通過(guò)對(duì)一系列電轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，穩(wěn)定得到了一個(gè)90％以上活率，60％以上外源基因表達(dá)率的電轉(zhuǎn)染方法，為核糖體基因區(qū)打靶載體更