核糖體基因區(qū)鋅指酶位點(diǎn)靶向載體的構(gòu)建及其打靶研究.pdf

1、核糖體基因(rDNA)區(qū)可能是一個(gè)安全有效的基因打靶區(qū)域，我室基于此開發(fā)的非病毒人源基因載體系統(tǒng)--核糖體基因區(qū)靶向載體，能攜帶多種治療基因在多種細(xì)胞系中成功打靶rDNA18S區(qū)+5468位點(diǎn)，且外源基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)。進(jìn)一步提高rDNA區(qū)的打靶效率可以更充分地發(fā)揮該區(qū)域作為基因治療靶位點(diǎn)的潛能，尤其在打靶病人來(lái)源的原代細(xì)胞方面帶來(lái)突破。近年來(lái)，鋅指酶作為提高基因打靶效率的有力工具被廣泛應(yīng)用，甚至能將打靶效率提高5000倍以上。我室針

2、對(duì)rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔1(ITS1)區(qū)+6523-+6546位點(diǎn)設(shè)計(jì)的鋅指酶ZFN-S3，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)均表明其具有較高的切割雙鏈DNA的活性。ZFN-S3可能是用于提高rDNA區(qū)打靶效率有效工具。
　　 目的：針對(duì)ZFN-S3的切割位點(diǎn)設(shè)計(jì)、構(gòu)建核糖體基因區(qū)鋅指酶位點(diǎn)靶向載體--pHr1-NL、pHr2-NL，證實(shí)該載體打靶rDNA區(qū)的可行性，為該載體聯(lián)合鋅指酶ZFN-S3高效打靶rDNA區(qū)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：載

3、體pHr1-NL的構(gòu)建：首先用PCR法克隆約2kb的rDNA同源序列。然后將無(wú)啟動(dòng)子但5’端有EMCV-IRES序列的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neo)基因亞克隆至同源序列的rDNA ITS1區(qū)，利用“啟動(dòng)子陷阱”策略富集同源重組子。并在Neo基因兩側(cè)加入同向的loxP位點(diǎn)，用于后續(xù)的特異性基因刪除。載體pHr2-NL的構(gòu)建：將pHr1-NL上rDNA+5513-+6523的同源序列替換成rDNA+937-+6523同源序列。將構(gòu)建好的載體pH

4、r1-NL、pHr2-NL利用核轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染人類纖維肉瘤(HT1080)細(xì)胞，通過(guò)篩選、挑取和計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆、鑒定定點(diǎn)整合等步驟，對(duì)其rDNA區(qū)的打靶進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果：1、構(gòu)建的載體pHr1-NL經(jīng)EcoRⅤ、ClaⅠ酶切鑒定，所獲得的酶切片段大小與理論值相符。2、構(gòu)建的載體pHr2-NL經(jīng)EcoRⅤ、AatⅡ酶切鑒定，所獲得的酶切片段大小與理論值相符。3、載體pHr1-NL、pHr2-NL的測(cè)序結(jié)果與理論序列相符。4、采用