核糖體基因區(qū)靶向TALENs與載體的構(gòu)建及其打靶研究.pdf

1、在我室的基因治療研究中，核糖體基因區(qū)(rDNA)由于其安全性及高效率，一直是我們進(jìn)行基因打靶的重要目的區(qū)域。我室也已經(jīng)成功構(gòu)建多種針對(duì)此區(qū)域的非病毒打靶載體—核糖體基因區(qū)靶向載體，這些同源重組載體能攜帶多種治療基因在多種細(xì)胞系中成功打靶rDNA區(qū)+5468位點(diǎn)，且外源基因能長(zhǎng)期穩(wěn)定地表達(dá)。TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）是一種嶄新的用于基因編輯的分子生物學(xué)工具。

2、利用TALE的序列模塊與內(nèi)切核酸酶FokI偶聯(lián)，可構(gòu)建成剪切任意特異DNA序列的核酸內(nèi)切酶TALEN，從而介導(dǎo)高效率的同源重組。以此核酸酶為剪切工具，或許能進(jìn)一步提高rDNA區(qū)的打靶效率。而由于TALEN切割內(nèi)源性DNA后產(chǎn)生的DNA雙鏈斷裂(DSB)通過(guò)NHEJ（非同源末端重接）進(jìn)行修復(fù)而產(chǎn)生不可預(yù)知突變的概率較高，核糖體基因區(qū)為高拷貝，其TALEN打靶過(guò)程中產(chǎn)生的突變會(huì)嚴(yán)重?cái)_亂基因組，影響細(xì)胞的存活及同源重組的效率。近期研究顯示，以

3、核酸酶為基礎(chǔ)的核酸切口酶(Nickase)的應(yīng)用可有效降低NHEJ引起的突變，促進(jìn)同源重組。
　　目的：研究特異識(shí)別與切割核糖體基因區(qū)5468位點(diǎn)的TALENs及TALE Nickases對(duì)rDNA區(qū)同源重組的促進(jìn)作用。
　　方法：⑴以限制性酶切連接的模塊組裝方法構(gòu)建rDNA區(qū)5468位點(diǎn)特異性的TALENs;⑵將下游的TALENs中FokI的催化域進(jìn)行點(diǎn)誘變，使FokI單體失活而形成Nickases;⑶用PCR的方法克隆5

4、468位點(diǎn)約1kb的長(zhǎng)同源臂、約600bp的短同源臂體及用于 Southern檢測(cè)的探針序列，連接構(gòu)建為無(wú)篩選基因的、用于檢測(cè)TALENs對(duì)同源重組促進(jìn)強(qiáng)度的打靶載體F9-Pro;⑷用TALENs及Nickases聯(lián)合F9-Pro及PHmF9打靶HT1080細(xì)胞及293T細(xì)胞，以定點(diǎn)整合PCR、測(cè)序等方法鑒定同源重組。
　　結(jié)果：①經(jīng)過(guò)酶切、測(cè)序、PCR等方法的鑒定，鑒定結(jié)果均符合理論預(yù)期，說(shuō)明成功構(gòu)建了序列正確的5468位點(diǎn)特異

5、性的TALENs、TALENickase及小型打靶載體F9-Pro質(zhì)粒;②以TALENs及TALENickases聯(lián)合F9-Pro打靶293T細(xì)胞3天后，在未經(jīng)過(guò)克隆篩選的條件下，混合細(xì)胞經(jīng)定點(diǎn)整合PCR的半定量分析發(fā)現(xiàn)了較明顯的同源重組，而并未在單轉(zhuǎn)F9-Pro的對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)同源重組;③以TALENs及TALENickases聯(lián)合pHmF9打靶HT1080細(xì)胞約半個(gè)月后，經(jīng)克隆篩選及鑒定發(fā)現(xiàn)，突變過(guò)的TALENickases組的抗性克