激光共聚焦和雙光子顯微鏡對(duì)細(xì)胞的成像及植物細(xì)胞Cytomixis的研究.pdf

1、近十年來(lái)，由于生物熒光成像技術(shù)和熒光探針技術(shù)的飛速發(fā)展，以及生物活體組織和細(xì)胞的三維成像在生命科學(xué)研究中的重要意義，目前，激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microcopy，簡(jiǎn)稱CLSM)是生物細(xì)胞和組織的三維成像最有效的設(shè)備，已經(jīng)普遍的在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。但由于一些因素的制約，成像效果還沒(méi)有達(dá)到非常理想的目標(biāo)。近年來(lái)，光學(xué)顯微鏡技術(shù)中的一個(gè)最引人注目的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(Two Photon

2、Excitation，簡(jiǎn)稱TPE)在激光共聚焦掃描顯微鏡中的廣泛應(yīng)用。雙光子技術(shù)可以使我們無(wú)需使用紫外光源就能達(dá)到檢測(cè)紫外熒光探針的目的。雙光子激光高度的三維空間分辨性(激發(fā)在很小的三次方空間內(nèi))和大的穿透深度使雙光子熒光成像技術(shù)迅速在生物細(xì)胞和組織(尤其是植物細(xì)胞組織)的活體三維成像研究方面獲得了廣泛的應(yīng)用。
　　 同樣，利用雙光子激光掃描顯微鏡對(duì)活體細(xì)胞成像也存在一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：那就是目前缺乏有效的雙光子熒光探針，因而利用傳統(tǒng)

3、熒光探針，雙光子激光掃描顯微鏡也很難使不透明的、較厚的活體組織在較深的層面上進(jìn)行清晰的熒光成像，目前國(guó)際上在活體植物不透明組織中成像研究中的最好記錄是60-70nm，這也是當(dāng)前生物學(xué)界對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激光掃描顯微鏡在應(yīng)用中存在爭(zhēng)論的焦點(diǎn)所在。因此，缺乏大吸收截面的熒光探針?lè)肿訃?yán)重制約了雙光子激光掃描顯微鏡的廣泛應(yīng)用。
　　 本文首先通過(guò)利用各種傳統(tǒng)的熒光探針和激光共聚焦顯微鏡以及雙光子激光掃描顯微鏡，對(duì)各種細(xì)胞及細(xì)

4、胞內(nèi)的成分進(jìn)行成像研究，從而對(duì)激光共聚焦顯微鏡及雙光子激光掃描顯微鏡細(xì)胞成像的技術(shù)有一個(gè)深入的研究和總結(jié)。其次，通過(guò)研究雙光子熒光探針的特性，我們合成并表征了幾個(gè)具有高靈敏度、高雙光子吸收截面的雙光子核酸熒光探針，BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC，同時(shí)利用這些探針對(duì)細(xì)胞核的雙光子成像進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為生命科學(xué)工作者們提供了幾個(gè)細(xì)胞膜半通透性的、真正意義上的雙光子核酸熒光探針。第三，通過(guò)利用高效熒光探針和激光共聚焦顯微鏡以及