急性乙醇中毒對(duì)大鼠海馬形態(tài)影響的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察.pdf

1、背景與目的：
　　乙醇作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，可抑制大腦皮層的活動(dòng)，使皮質(zhì)下中樞的興奮失去控制，從而誘發(fā)腦功能紊亂，導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)行為功能的改變，造成學(xué)習(xí)、記憶認(rèn)知、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等多種行為功能障礙。因此乙醇的過量飲用可嚴(yán)重影響醉酒者的身心健康，導(dǎo)致交通事故、家庭社會(huì)暴力等一系列不良后果，給社會(huì)和家庭帶來極大的危害。但目前國內(nèi)外研究多集中在慢性乙醇中毒對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)帶來的不良影響，對(duì)急性乙醇中毒的研究報(bào)道較少。本研究選取大鼠給予不同劑量

2、的乙醇灌胃后建立急性乙醇中毒動(dòng)物模型，采用HE染色及免疫熒光法結(jié)合激光共聚焦觀察乙醇中毒后海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化情況，探討急性乙醇中毒所致病變基礎(chǔ)及其可能作用機(jī)制，為今后的相關(guān)研究提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法：
　　1.SD大鼠，雌雄不限，體重250g左右，隨機(jī)分組，酒精濃度為56％（v/v）（紅星二鍋頭）2.分為四個(gè)劑量組：對(duì)照組、低劑量（4ml/kg）、中劑量組（8ml/kg）、高劑量組（16ml/kg）。分別處理1h、2h、4

3、h、8h、12h。對(duì)照組給予相應(yīng)體積的生理鹽水，制作低、中、高劑量急性乙醇中毒模型。3.采用HE染色法觀察急性乙醇中毒后海馬形態(tài)的變化情況4.采用免疫熒光法觀察不同時(shí)間段急性乙醇中毒后海馬神經(jīng)元 NeuN的表達(dá)5.利用激光共聚焦觀察不同時(shí)間段急性乙醇中毒后經(jīng)過熒光雙染的NeuN及DAPI的海馬神經(jīng)元表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1. HE染色結(jié)果顯示，給予大鼠不同濃度乙醇灌胃后，與對(duì)照組相比，乙醇組中齒狀回神經(jīng)元的胞體厚度未發(fā)生明顯

4、的變化，但其神經(jīng)元細(xì)胞的排布卻表現(xiàn)為不同程度的改變。大鼠給予4 ml/kg乙醇灌胃1 h及2 h后齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞并未發(fā)生明顯的改變，作用4h后可見齒狀回內(nèi)顆粒細(xì)胞排布呈現(xiàn)輕微的疏松狀，作用至8 h時(shí)，顆粒細(xì)胞的排布已恢復(fù)至正常結(jié)構(gòu)；8 ml/kg和16 ml/kg乙醇處理組可見部分齒狀回顆粒細(xì)胞胞體出現(xiàn)明顯水腫，給予大鼠乙醇灌胃2h后，8 ml/kg乙醇處理組與對(duì)照組相比無明顯差別，4 h時(shí)可見齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯排列紊亂、疏松，

5、細(xì)胞間隙增大，8 h時(shí)其細(xì)胞排布結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)至正常狀態(tài)，至12 h時(shí)，齒狀回內(nèi)細(xì)胞的密度已與對(duì)照組相當(dāng)；而16 ml/kg乙醇處理在灌胃后2h即可觀察到齒狀回細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞密度的降低，細(xì)胞間隙的增大等，4 h時(shí)乙醇對(duì)齒狀回內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷進(jìn)一步加重，與對(duì)照組相比，可見細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞排布的緊密度降低，灌胃8h后，在齒狀回內(nèi)可觀察到明顯的空隙結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元細(xì)胞排布分散零亂，其層狀結(jié)構(gòu)已完全消失，由此可知高濃度的乙醇可導(dǎo)致

6、齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞致密結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，至灌胃12 h時(shí)，齒狀回顆粒細(xì)胞排布結(jié)構(gòu)尚未恢復(fù)至正常。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，乙醇處理組中齒狀回神經(jīng)元 NeuN熒光表達(dá)強(qiáng)度減弱。乙醇灌胃1 h后，4 ml/kg、8 ml/kg及16 ml/kg乙醇處理組大鼠齒狀回及海馬CA3及CA4中NeuN的表達(dá)量即表現(xiàn)為不同程度的減少；作用2 h時(shí)，大鼠齒狀回及海馬CA3及CA4神經(jīng)元中NeuN的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步減弱，提示酒精可導(dǎo)致神

7、經(jīng)元細(xì)胞密度的降低，在形態(tài)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為齒狀回內(nèi)顆粒細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞排列疏松、紊亂，海馬CA3及CA4錐體細(xì)胞數(shù)目減少，分布散亂；至4 h時(shí)，8 ml/kg及16 ml/kg乙醇處理組中NeuN表達(dá)量持續(xù)減少，僅可在齒狀回及海馬CA3及CA4局部區(qū)域內(nèi)觀察到NeuN表達(dá)分布，可見大量的空隙樣結(jié)構(gòu)分布，上述結(jié)果提示齒狀回顆粒細(xì)胞的層狀排布結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，海馬內(nèi)錐體細(xì)胞損傷程度進(jìn)一步加劇。至8 h時(shí)，4 ml/kg乙醇處理組NeuN熒光強(qiáng)度已

8、與對(duì)照組相當(dāng)，而中高劑量組在乙醇灌胃后12 h時(shí)其齒狀回NeuN表達(dá)尚未恢復(fù)至正常水平，且細(xì)胞排布仍呈現(xiàn)為松散態(tài)。
　　3.激光共聚焦NeuN+dapi表達(dá)結(jié)果可知，neun標(biāo)記神經(jīng)元核，DAPI可標(biāo)記所有細(xì)胞的胞核，乙醇灌胃1 h后，4 ml/kg、8 ml/kg及16 ml/kg乙醇處理組大鼠齒狀回及海馬CA3及CA4中NeuN的表達(dá)開始減弱；作用2 h時(shí)，大鼠齒狀回及海馬CA3及CA4神經(jīng)元中NeuN的表達(dá)進(jìn)一步減弱，形態(tài)結(jié)

9、構(gòu)上出現(xiàn)齒狀回內(nèi)顆粒細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞排列疏松、紊亂，海馬CA3及CA4錐體細(xì)胞數(shù)目減少，分布散亂；至4 h時(shí)，8 ml/kg及16 ml/kg乙醇處理組中NeuN熒光表達(dá)量較弱，僅可在齒狀回及海馬CA3及CA4局部區(qū)域內(nèi)可觀察到NeuN表達(dá)分布，齒狀回顆粒細(xì)胞的層狀排布結(jié)構(gòu)明顯受損，可見空隙樣結(jié)構(gòu)分布，海馬內(nèi)錐體細(xì)胞損傷程度進(jìn)一步加劇，可見少數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)為空泡樣結(jié)構(gòu)。至8 h時(shí)，4 ml/kg組NeuN熒光強(qiáng)度已與對(duì)照組無明顯差別，而中