沙田柚花粉離體萌發(fā)與花粉管特異蛋白電泳分析研究.pdf

1、沙田柚(Citrusgrandisvar.ShatinyuHort.)是南方果樹中的重要樹種，是典型的配子體自交不親和植物，為研究配子體自交不親和機(jī)理的好材料。然而嚴(yán)重的自交不親和使沙田柚必須通過(guò)人工授粉才能結(jié)果，增加了生產(chǎn)成本。研究沙田柚的自交不親和機(jī)理具有重要生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值和理論意義。本研究以沙田柚花粉為試材，研究了貯藏溫度、解凍方式、含水量對(duì)花粉萌發(fā)的影響，還研究了溫度、酸堿度、糖含量、聚乙二醇以及不同花柱蛋白對(duì)花粉管生長(zhǎng)的影響，并

2、對(duì)添加自交和異交花柱蛋白培養(yǎng)的沙田柚花粉管蛋白進(jìn)行了分離提取和電泳比較，分析了沙田柚自交不親和的可能作用機(jī)制，提出了沙田柚花粉離體萌發(fā)和花粉管培養(yǎng)的優(yōu)化方案。具體結(jié)果如下：　　1.研究了不同貯藏條件對(duì)沙田柚花粉萌發(fā)的影響。對(duì)貯藏花藥含水量的研究表明，含水量在11.8％～15.5％范圍內(nèi)的花藥能保持80％以上的花粉萌發(fā)率，過(guò)高或過(guò)低含水量都會(huì)使貯藏花粉的活性降低。對(duì)貯藏溫度的研究表明，隨著貯藏溫度的降低，沙田柚花粉的活性保持時(shí)間增長(zhǎng)，在

3、-70℃超低溫冰箱中貯藏一年以后仍能保持80％左右的萌發(fā)率。對(duì)解凍方式的研究表明，分步解凍比其它方式更能保持超低溫貯藏沙田柚花粉的活性。因此沙田柚花粉貯藏的優(yōu)化方案為：當(dāng)天開花的花藥于電熱吹風(fēng)干燥箱中，25℃恒溫2h，吹干表面水分，再置于25℃恒溫房中自然晾干至花藥完全散開并花藥壁翻轉(zhuǎn)，測(cè)定花藥含水量在11.8％～15.5％范圍內(nèi)，在保持干燥的情況下，置-70℃超低溫冰箱中貯藏。　　2.研究了培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)液成分對(duì)沙田柚花粉萌發(fā)和花粉

4、管生長(zhǎng)的影響。對(duì)培養(yǎng)溫度的研究表明，沙田柚花粉的最適離體培養(yǎng)溫度范圍在28℃～31℃之間，低溫使花粉萌發(fā)率降低，而高溫會(huì)使花粉在短時(shí)間內(nèi)失去活性。對(duì)培養(yǎng)方式的研究表明，沙田柚花粉的萌發(fā)是一個(gè)需氧過(guò)程，應(yīng)盡量使花粉分布于培養(yǎng)液表面才能保持高萌發(fā)率。對(duì)培養(yǎng)液酸堿度的研究表明，沙田柚花粉需要在弱酸性環(huán)境中培養(yǎng)，其培養(yǎng)液的最適pH值在5.0～5.6之間。對(duì)培養(yǎng)液蔗糖含量的研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液蔗糖濃度15～30％的范圍內(nèi)，沙田柚花粉能保持較高的萌發(fā)率

5、，花粉管生長(zhǎng)的平均長(zhǎng)度也相似，為230um左右，其中15％和20％兩種蔗糖濃度培養(yǎng)液中的花粉管長(zhǎng)勢(shì)整齊。蔗糖濃度低于15％和高于30％的培養(yǎng)液均會(huì)降低沙田柚花粉的萌發(fā)率，影響花粉管的生長(zhǎng)。蔗糖對(duì)于花粉管離體生長(zhǎng)的作用可能包括為花粉萌發(fā)和生長(zhǎng)提供碳源以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液滲透壓兩方面。對(duì)培養(yǎng)液中PEG的研究表明，培養(yǎng)液中最適PEG濃度為20％，PEG與蔗糖配合使用，可以顯著提高花粉管的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，平均長(zhǎng)度可增加3倍以上達(dá)728.0um，PEG對(duì)于沙

6、田柚花粉離體培養(yǎng)的作用可能包括四個(gè)方面：一是保持培養(yǎng)液物理?xiàng)l件的穩(wěn)定，二是能較長(zhǎng)時(shí)間維持花粉膨壓，促進(jìn)花粉管生長(zhǎng)，三是有利于花粉漂浮于培養(yǎng)液表面，四是抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。因此，得到沙田柚花粉萌發(fā)和花粉管培養(yǎng)的優(yōu)化程序?yàn)椋嘿A藏在-70℃超低溫冰箱中的沙田柚花粉，經(jīng)分步解凍后，均勻?yàn)⒉ビ趦?yōu)化培養(yǎng)液上，在28～31℃下培養(yǎng)24h。沙田柚花粉的優(yōu)化培養(yǎng)液配方為：0.02％硫酸鎂，0.01％硝酸鉀，0.03％硝酸鈣，0.01％硼酸，15％蔗糖、20％P

7、EG6000(pH5.0～5.6)。　　3.添加沙田柚自交、異交花柱蛋白后，花粉的萌發(fā)未受影響，但花粉管的生長(zhǎng)情況在兩者之間有明顯差異。添加異交花柱蛋白對(duì)花粉管的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，而添加自交花柱蛋白培養(yǎng)的花粉管的生長(zhǎng)受到抑制。對(duì)兩種花粉管的可溶性蛋白進(jìn)行的電泳分發(fā)現(xiàn)：PAGE電泳顯示自交花柱蛋白處理的花粉管出現(xiàn)了1條特異蛋白帶(Rf值=0.81)；SDS-PAGE電泳檢測(cè)到自交花柱蛋白處理的花粉管出現(xiàn)了相對(duì)分子量為35.0kd和37.5k