青島文昌魚體液酚氧化酶：分離、純化、鑒定、誘導(dǎo)形成及其基因克隆.pdf

1、酚氧化酶(phenoloxidase)又稱為酪氨酸酶(tyrosinase，ECl.14.18．1)。它是一種含銅的酶，能夠催化單酚羥化成二酚(如多巴)，把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素(Lerch K，1988)。酚氧化酶在脊椎動物和無脊椎動物中得到了廣泛的研究，然而在進化上占據(jù)關(guān)鍵位置的文昌魚中的酚氧化酶的研究卻比較少。我們實驗室以前的研究證實文昌魚皮膚粘液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原，并對其組織分布和抗菌活性

2、及其在胚胎發(fā)育過程中的變化進行了研究。然而，在文昌魚體液中是否存在酚氧化酶(一種可能在文昌魚的免疫和防御系統(tǒng)中擔(dān)任重要角色的酶)，目前還不清楚。 我們以青島文昌魚(Branchiosroma belcheri tsingtauense)為實驗材料，首先，用分光光度法和電泳與生化染色相結(jié)合技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)酚氧化酶存在于文昌魚體液中，且主要以酶原形式存在；其最適溫度是30℃-35℃，最適pH是7.0—7.5。酚氧化酶原可以被外源性激活

3、劑如胰蛋白酶、酵母聚糖和脂多糖激活；在10 mM鈣離子存在，外源激活劑引起的激活作用明顯增強。但是外源激活劑引起的激活作用可以被蛋白酶抑制因子(STI和pNPGB)所抑制。另外，非變性電泳結(jié)合酶特異性染色證明酚氧化酶分子量約150 kDa，變性后為三條帶，其分子量約44、46和72 kDa。這是有關(guān)對頭索動物文昌魚體液中存在酚氧化酶和酚氧化酶原的首次報道。 為進一步研究文昌魚體液中酚氧化酶的特性，我們用硫酸氨分級沉淀、凝膠過濾層

4、析、離子交換層析三種分離純化技術(shù)相結(jié)合，從文昌魚體液中純化出了酚氧化酶。純化的酚氧化酶用非變性電泳顯示一條分子量約150 kDa的帶，而變性后為三條帶，其分子量約44，46和72 kDa。這說明文昌魚體液中的酚氧化酶可能是一個通過二硫鍵連接的異三聚體蛋白。底物特異性和抑制劑實驗的研究證明文昌魚體液中酚氧化酶氧化O-diphenols(如Dopamine和4-methylcatecho1)的 活性較強，而氧化P-diphenol s(如

5、Hydroquinone和Methylhydroquinone)的活性較弱；且苯硫脲能強烈抑制體液中酚氧化酶活性，而疊氮化鈉對其活性抑制較弱； 由此推測文昌魚體液中酚氧化酶可能是一種酪氨酸酶型。另外，利用抗體制備技 術(shù)制備了文昌魚體液中酚氧化酶的多克隆抗體，并用western Blot對其進行了鑒 定，證明44、46和72 kDa三條帶都能和抗體雜交。為研究酚氧化酶是否也參與文昌魚的免疫反應(yīng)，我們用大腸桿菌和溶藻膠弧 菌攻

6、擊文昌魚，并對其攻擊前后體液中的酚氧化酶的活性進行了檢測，發(fā)現(xiàn)文昌 魚被細(xì)菌攻擊后，體液中酚氧化酶的活性顯著增高。電泳和生化染色檢測結(jié)果說 明誘導(dǎo)后文昌魚體液中酚氧化酶活性的增加主要是三個亞基中的亞基2也就是46 kDa帶的顯著變化引起。這是首次關(guān)于文昌魚免疫分子一酚氧化酶可以被微生物 誘導(dǎo)的報道。 最后，我們利用RT-PCR技術(shù)和RACE技術(shù)克隆出了文昌魚的酚氧化酶基因(AmphiTYR)。AmphiTYR的cDNA序

7、列為1048 bp，包含一個555 bp的開放閱讀框，編碼一個185氨基酸蛋白。其中包含一個銅離子結(jié)合保守位點(CuB)。這和無脊 椎動物酚氧化酶和脊椎動物酪氨酸酶都含有兩個銅結(jié)合位點不同。序列相似性比 較分析結(jié)果顯示，AmphiTYR鵬脊椎動物的酪氨酸酶和無脊椎動物酚氧化酶的相似 性分別為25-30[％]和10-15[％]左右。構(gòu)建的進化樹結(jié)果顯示，文昌魚的AmphiTYR 處于無脊椎動物的酚氧化酶和脊椎動物的酪氨酸酶之間。這