鴨梨多酚氧化酶基因克隆及其反義轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、在梨果實生產(chǎn)和加工過程中，多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)的大量存在引發(fā)了果實的迅速褐變，給果品的外觀品質(zhì)和加工性能帶來了嚴(yán)重的影響，已經(jīng)成為困擾我國梨果品生產(chǎn)和經(jīng)營的主要難題之一，生產(chǎn)上急需對其進行性狀改良。本研究以降低原產(chǎn)我國梨品種——鴨梨果實組織內(nèi)多酚氧化酶含量為目標(biāo)，圍繞著多酚氧化酶基因開展了基因克隆、序列分析、反義表達載體構(gòu)建以及遺傳轉(zhuǎn)化等一系列研究，最終獲得了低多酚氧化酶活性的轉(zhuǎn)基因鴨梨植株，從而為

2、從根本上解決梨果實褐變問題、培育抗褐變梨新品種奠定了基礎(chǔ)。所取得的主要成果如下所示：
　　 1.根據(jù)多酚氧化酶基因保守序列設(shè)計一對引物，以鴨梨果實cDNA為模板擴增得到1782bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA片段，并以此序列為基礎(chǔ)RACE擴增該基因cDNA全長，得到了長度的2126bp的鴨梨多酚氧化酶基因cDNA全長序列，進一步根據(jù)得到的cDNA序列開放性讀碼框設(shè)計引物擴增得到鴨梨多酚氧化酶基因DNA序列，結(jié)果顯示該基因cDNA

3、序列和DNA序列堿基組成無差異，證實鴨梨多酚氧化酶基因組成上不具備內(nèi)含子。
　　 2.對鴨梨多酚氧化酶基因所翻譯氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明該氨基酸序列與其它物種多酚氧化酶高度同源，且包含一個由210個氨基酸殘基組成的酪氨酸酶超級家族保守結(jié)構(gòu)域，具有一個酪氨酸酶CuA結(jié)合位點和一個酪氨酸CuB結(jié)合位點，證實鴨梨多酚氧化酶屬酪氨酸酶超級家族成員，該酶在發(fā)揮酶促作用時需要Cu2+作為輔因子。
　　 3.基于所獲得的

4、氨基酸序列對鴨梨多酚氧化酶進行蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示鴨梨多酚氧化酶應(yīng)屬于全α-結(jié)構(gòu)的珠蛋白型α-螺旋蛋白；該蛋白的疏水性氨基酸位于分子內(nèi)部，親水性氨基酸位于分子表面，具有可溶性親水蛋白的典型特征，不具備跨膜結(jié)構(gòu)，故推測鴨梨多酚氧化酶在細胞中的定位應(yīng)該位于類囊體腔中。
　　 4.首次構(gòu)建了鴨梨葉片再生體系，確定鴨梨最佳葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+BA3.0mg/L+IAA0.5mg/L，再生頻率和再生芽數(shù)分別為80％和1

5、.77；最佳增殖培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+IBA0.5mg/L，增殖系數(shù)可達2.23；最佳繼代培養(yǎng)基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L，平均苗高4.98cm；最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+蔗糖30g/L+IBA0.5mg/L，生根率和平均根數(shù)分別為50％和2.04。
　　 5.首次構(gòu)建了鴨梨多酚氧化酶基因的反義表達載體。根據(jù)所克隆到的鴨梨多酚氧化酶基因序列，選擇3’端450bp序列片段，與切除Gus基因的

6、真核表達載體pBI121反向連接后，電轉(zhuǎn)儀法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，經(jīng)酶切和PCR鑒定證實，鴨梨多酚氧化酶基因反義表達載體構(gòu)建成功，并已整合到農(nóng)桿菌上。
　　 6.首次優(yōu)化建立了鴨梨的遺傳轉(zhuǎn)化體系。在鴨梨葉片再生體系的基礎(chǔ)上對影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化的各方面因素進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，當(dāng)葉盤預(yù)培養(yǎng)2天，農(nóng)桿菌菌液濃度OD600=0.4、侵染5min、共培養(yǎng)2天時出愈率和轉(zhuǎn)化率最高，而愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加400μg/ml的羧芐青霉素