小麥多酚氧化酶基因克隆分析及其分子標(biāo)記開發(fā).pdf

1、面粉及其面制品色澤是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)性狀的最重要指標(biāo)之一，小麥籽粒中多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是導(dǎo)致其褐變的主要原因。褐變不僅影響面粉及其面制品的表觀品質(zhì)，也會(huì)造成食品特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的缺失。因此，對(duì)小麥中多酚氧化酶的分子遺傳特性，以及其與小麥色澤品質(zhì)性狀之間的關(guān)系進(jìn)行研究，既能為我國(guó)小麥品質(zhì)性狀的改良提供參考和理論依據(jù)，也在我國(guó)糧食安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展等方面具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。本研究以我國(guó)地方農(nóng)家種群體211份小麥

2、品種為材料，用L-DOPA的方法測(cè)定其籽粒的PPO活性并進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用小麥A、B、D染色體組不同的分子標(biāo)記，對(duì)參試材料進(jìn)行了多酚氧化酶基因的分子檢測(cè)，分析研究了不同基因類型的分布和其與PPO活性之間的關(guān)系。通過同源克隆的方法，對(duì)2BL染色體上的PPO基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，開發(fā)了2BL染色體上PPO活性的分子標(biāo)記并進(jìn)行驗(yàn)證，主要結(jié)果如下:
　　1.我國(guó)地方農(nóng)家種群體籽粒PPO活性總體均值為29.06AU min-1g-1

3、，變幅在9.23AU·min-1·g-1～57.34AU min-1g-1，PPO活性變異范圍廣泛，具備較大的遺傳改良的潛質(zhì)，通過聚類分析對(duì)PPO活性進(jìn)行了歸類，分為低(＜17AU min-1·g-1)、較低(17～27AU·min-1·g-1)、中間(27～35AU min-1g-1)、較高(36～43AU·min-1g-1)、高(＞43AU·min-1·g-1)五個(gè)區(qū)間。參試材料PPO活性在五個(gè)區(qū)間整體呈正態(tài)分布，較低活性類型區(qū)間的

4、材料最多，為58份，占27.5％
　　2.我國(guó)地方農(nóng)家種群體中，Ppo-A1b(低PPO活性類型）、Ppo-B1a（低PPO活性類型）和Ppo-D1b（高PPO活性類型）基因型分布頻率較高，分別為739％、81.5％和63.2％。Ppo-A1a基因型活性均值為40.5AU·min-1g-1顯著高于其他類型，Ppo-D1a基因型活性均值最低，為20.2AU·min-1g-1。分別用A、B、D染色體分子標(biāo)記對(duì)活性區(qū)間的分布進(jìn)行分析，結(jié)

5、果表明PPO活性越高Ppo-A1a和Ppo-D1b類型出現(xiàn)的可能性越大，PPO活性越低Ppo-A1b和Ppo-D1a出現(xiàn)的可能性越大，B組染色體F-8擴(kuò)增類型的分布沒有明顯的趨勢(shì)。
　　3.參試211份農(nóng)家種材糊中，中間活性區(qū)間的Ppo-A1b/Ppo-B1b/Ppo-D1a(3186AU min-1g-1)基因型材料最多，頻率為39.3％，高活性區(qū)間的Ppo-A1a/Ppo-B1a/Ppo-D1b(45.92AU min-1·g

6、-1)和Ppo-A1a/Ppo-B1b/Ppo-D1b（43.06AU min-1g-1）基因型頻率分別為1％和13.4％，低活性區(qū)間的Ppo-A1b/Ppo-B1a/Ppo-D1a(15.32AU·min-1g-1)和Ppo-A1b/Ppo-B1b/Ppo-D1a(15.81AU·min-1·g-1)基因型頻率分別為6.5％和22.9％。相同基因組合的材料仍有部分出現(xiàn)活性偏離，從不同分子標(biāo)記組合來看PPO18、PPO16和PPO29效

7、應(yīng)顯著，F(xiàn)-8效應(yīng)有限，A、B、D三組染色體分子標(biāo)記結(jié)合使用能增加選擇的區(qū)分度和效率。
　　4.利用同源克隆的方法克隆了普通小麥2BL染色體上一個(gè)PPO同源基因，其gDNA序列為1824bp，cDNA序列為1575bp，編碼524個(gè)氨基酸，分子量為58.58kD，等電點(diǎn)pl為6.58。用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行分析預(yù)測(cè)得知，其具有三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為Tyrosinase、PPO1_DWL和PPO1_KFDV，為親水性蛋白，沒有信號(hào)肽

8、.不具備跨膜結(jié)構(gòu)，有18處絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)，17處蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)和3處酪氨酸（Tyr)磷酸化位點(diǎn)。
　　5.開發(fā)了2BL染色體PPO活性分子標(biāo)記PPO-B5，能擴(kuò)增出三個(gè)條帶（a帶、b帶、c帶），共有四種不同類型，分別命名為A類型（a帶、b帶、c帶）活性均值為29.75AU·min-1·g-1、B類型（b帶、c帶）活性均值為27.16AU·min-1·g-1、C類型（a帶、c帶）活性均值為34.39AU·mi

9、n-1·g-1、D類型（c帶）活性均值為23.78AU·min-1·g-1，四種類型在(P＜0.05)水平差異顯著。序列分析表明a帶為431bp，與GQ30713.1相似度為99％，b帶為230bp，與AB254804.1相似度為99％，序列差異發(fā)生在AB254804.1第二內(nèi)含子的201bp缺失和12個(gè)SNP，c帶為192bp，其來自于A組染色體。結(jié)合A、D組染色體分子標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，211份農(nóng)家種