細(xì)粒棘球蚴延伸因子-1和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因克隆表達(dá)及免疫診斷研究.pdf

1、目的：1.運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對細(xì)粒棘球蚴延伸因子-1和磷酸丙糖異構(gòu)酶T、B細(xì)胞表位以及各級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，獲得可取的抗原表位，對兩者的免疫診斷性初步分析，了解其診斷價(jià)值。2.利用原核表達(dá)技術(shù)，通過對上述兩種基因構(gòu)建表達(dá)載體，獲得重組蛋白，為后期免疫保護(hù)和診斷價(jià)值等研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：1.經(jīng)Expasy系統(tǒng)預(yù)測兩種基因的理化性質(zhì)，使用DNAStar軟件來分析蛋白親水性、柔性區(qū)域、抗原指數(shù)及表面可及性，利用 ABCpred與 I

2、EDB軟件綜合預(yù)測B細(xì)胞線性抗原表位，通過DNAStar軟件預(yù)測T細(xì)胞表位，使用SOPMA軟件預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL網(wǎng)站構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。使用 DNAstar軟件對Eg和人類EF-1、TPI的氨基酸序列進(jìn)行比對。2.通過RT-PCR獲得目的基因與克隆載體連接形成重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒與pET-28α(+)經(jīng)雙酶切連接成原核表達(dá)重組質(zhì)粒，表達(dá)、純化目的蛋白。用ELISA方法分別對37例囊型包蟲、29例泡型包蟲患者、16例正常人的血清

3、檢出率測定，了解其診斷價(jià)值。
　　結(jié)果：1.EgEF-1親水性得分較高的區(qū)域有7個；6個柔性區(qū)域；抗原性指數(shù)得分較高的區(qū)域分布與柔性區(qū)域一致；表面可及性得分較高的區(qū)域較少；可能的B細(xì)胞線性表位區(qū)域是：120-130、286-295、306-320、365-378；可能的優(yōu)勢性T細(xì)胞表位區(qū)域是：34-48、164-177、222-244、280-290、321-330、396-407；EgEF-1的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占32.81％、β

4、折疊22.54%、β轉(zhuǎn)角10.94%、無規(guī)則卷曲33.71%；序列比對，EgEF-1與人類EF-1的一致性為35.06%，EgTPI與人類TPI的一致性為8%。EgTPI親水性得分較高的區(qū)域有8個；8個柔性區(qū)域；抗原性指數(shù)得分較高的區(qū)域分布與柔性區(qū)域大部分一致；表面可及性得分較高的區(qū)域分布區(qū)域相對較少；可能的B細(xì)胞線性表位的氨基酸序列為：28-39、50-60、70-80、131-139、150-159、213-231。EgTPI二級結(jié)

5、構(gòu)中α螺旋占36%、β折疊22.00%、β轉(zhuǎn)角12.00%、無規(guī)則卷曲30.00%；可能的優(yōu)勢性T細(xì)胞表位區(qū)域?yàn)椋?6-30、71-85、98-119、142-154、178-200。2.成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，誘導(dǎo)純化出重組蛋白EgEF-1的分子量在34KD左右，EgTPI的分子量在27KD左右。ELISA結(jié)果顯示，EgEF-1血清檢測陽性率為0，但OD值普遍較高，EgTPI細(xì)粒棘球蚴病患者陽性檢出率為86.48%，多房棘球蚴患者陽性檢

6、出率為72.41%，與健康人群比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但CE和AE間差異沒有顯著性。
　　結(jié)論：1.通過對抗原表位的預(yù)測，EgEF-1有4個B細(xì)胞表位的區(qū)域、6個優(yōu)勢性T細(xì)胞表位區(qū)域，EgTPI有6個可能形成B細(xì)胞表位的區(qū)域、5個優(yōu)勢性T細(xì)胞表位區(qū)域，這些抗原表位預(yù)示可作為免疫診斷和藥物治療靶點(diǎn)2.成功純化重組蛋白后,EgEF-1對兩種病人血清檢測結(jié)果無陽性例數(shù)；EgTPI檢測結(jié)果表明，細(xì)?；颊吲c多房患者之間存在