細粒棘球蚴谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶免疫保護力觀察及其免疫機制的研究.pdf

1、目的:在已克隆并成功構(gòu)建細粒棘球蚴（Echinococcus granulosus,Eg）重組原核表達質(zhì)粒pET-28a/GST的基礎(chǔ)上，表達并純化出重組蛋白Eg.GST，進行動物免疫保護力實驗及免疫機制研究，以鑒定其疫苗的潛質(zhì)。
　　 方法:（1）重組表達質(zhì)粒的誘導表達及純化：IPTG誘導表達重組蛋白EgGST（rEgGST），經(jīng)含Ni2+的His-bind樹脂柱純化rEgGST。（2）動物分組及免疫方案：選取132只雌性6周

2、齡ICR小鼠隨機分為3組即實驗組、佐劑+PBS組和PBS組，每組44只；采用背部皮下多點注射，連續(xù)免疫3次，每次間隔兩周；免疫小鼠10周后，每只小鼠用1500個活原頭蚴腹腔注射進行攻擊感染。分別于免疫前和攻擊后的0周、2周、4周、6周、10周、18周、30周剖殺小鼠，并且眼眶取血分離血清。（3）rEgGST誘導小鼠的免疫保護力的計算：根據(jù)Dempster公式：免疫保護力（％）=（1-免疫組平均包囊數(shù)/對照組平均包囊數(shù)）×100﹪，計算免

3、疫保護力（4）rEgGST誘導小鼠的免疫保護力及其機制研究：①通過ELISA方法對rEgGST誘導小鼠體液免疫指標的變化進行研究；②通過流式技術(shù)對rEgGST誘導小鼠細胞免疫指標的變化進行研究；③rEgGST誘導小鼠細胞因子變化的研究及MTT法檢測小鼠脾淋巴細胞增殖情況。
　　 結(jié)果（1）：將已經(jīng)構(gòu)建的基因工程菌株Eg.GST/pET-28a/BL21(DE3) plysS，表達并純化出分子量約28kD的重組EgGST。（2）：

4、根據(jù)公式計算rEgGST能誘導小鼠產(chǎn)生89.39％的免疫保護力。（3）①rEgGST組小鼠在抗原免疫后和攻擊感染后均產(chǎn)生高水平的IgG、低水平的IgG1和IgE，IgG2a、IgG2b和IgG3抗體水平與免疫前相比是升高的，提示IgG、IgG3、IgG2a和IgG2b可能參與保護性的免疫應(yīng)答機制。②rEgGST組小鼠在攻擊感染后不僅CD4+T細胞增加，CD8+T細胞也有輕度增加，CD4+/CD8+比值與PBS對照組比較有所降低；在攻擊感

5、染后30周rEgGST組的CD25+細胞和佐劑組與空白組相比差異具有顯著性，而實驗組與對照組之間無顯著性差異。③rEgGST組小鼠在免疫后產(chǎn)生高水平的IL-2、IFN-γ和TNF-α，低水平的IL-4和IL-10；攻擊感染后期IL-2、IFN-γ和TNF-α降低，IL-4和IL-10上升。提示該重組抗原以誘導Th1型免疫應(yīng)答為主的反應(yīng)；同時攻擊感染后進行脾淋巴細胞增殖試驗，MTT法檢測證實rEgGST免疫的小鼠在rEgGST刺激下脾淋巴