土耳其斯坦東畢吸蟲肌動(dòng)蛋白基因的克隆和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因的克隆及表達(dá).pdf

1、東畢吸蟲病是由分體科東畢屬的各種吸蟲寄生于牛、羊等哺乳動(dòng)物的門靜脈和腸系膜靜脈而引起的一種血吸蟲病。該病在我國分布極其廣泛，給畜牧業(yè)帶來極大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)東畢吸蟲的尾蚴可使人患尾蚴性皮炎，也稱稻田皮炎，嚴(yán)重影響人類的身體健康，是一種非常重要的人畜共患寄生蟲病。 目前對(duì)東畢吸蟲病的防制還存在諸多困難，首先，實(shí)踐證明通過殺滅血吸蟲的中間宿主──螺類來防治血吸蟲感染的效果是不明顯的；其次，通過吡喹酮治療血吸蟲病雖然效果很好，但也存在治

2、療費(fèi)用高、不能防止重復(fù)感染以及耐藥性的產(chǎn)生等缺點(diǎn)，現(xiàn)普遍認(rèn)為有必要研究血吸蟲的疫苗來預(yù)防此病。本研究克隆了土耳其斯坦東畢吸蟲肌動(dòng)蛋白基因（ACTIN）和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因（TPI）的全長序列，并將磷酸丙糖異構(gòu)酶基因在畢赤酵母中高效表達(dá)。 首先，根據(jù)日本血吸蟲和曼氏血吸蟲肌動(dòng)蛋白基因和磷酸丙糖異構(gòu)酶基因核苷酸序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR從土耳其斯坦東畢吸蟲成蟲總RNA分別擴(kuò)增ACTIN和TPI的中間大片段，再根據(jù)已知序列

3、利用5RACE和3RACE技術(shù)分別擴(kuò)增出ACTIN和FPI的5’和3’端，將三段序列拼接得到ACTIN和TPi的全長cDNA序列并登錄GeneBank，登錄號(hào)為：ACTIN為DQ017265，TPI為DQ092331。 其次，根據(jù)TPI全長cDNA序列設(shè)計(jì)兩條加有EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR擴(kuò)增TPI全長序列并克隆到pMD18-T載體，EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切重組載體pMD18-T／TPI后將獲

4、得的全長TPI亞克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9k構(gòu)成重組表達(dá)載體pPIC9k／TPI，Sal Ⅰ酶切重組表達(dá)載體pPIC9k／TPI后電擊轉(zhuǎn)化到酵母菌株GS115感受態(tài)細(xì)胞中，用組氨酸缺陷培養(yǎng)基和G418依次篩選多拷貝質(zhì)粒整合的畢赤酵母菌株。重組酵母細(xì)胞在含甲醇的培養(yǎng)基中分泌表達(dá)目的蛋白，培養(yǎng)3d后收取上清，SDS-PAGE顯示表達(dá)的蛋白分子量為43kDa，進(jìn)行westernblot分析結(jié)果表明該蛋白被自然感染東畢吸蟲的綿羊血清所識(shí)別

5、。蛋白表達(dá)時(shí)相分析表明，甲醇誘導(dǎo)72h蛋白表達(dá)產(chǎn)量最高。表達(dá)產(chǎn)物通過葡聚糖凝膠G-75層析柱純化，測(cè)定蛋白濃度為1200mg／L。 最后，用純化的蛋白免疫新西蘭大白兔，ELISA分析結(jié)果表明：空白組的抗體水平一直處于平穩(wěn)的狀態(tài)，而免疫組在免疫后抗體水平呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，一次免疫組和加強(qiáng)免疫組的抗體水平均在第四周達(dá)到峰值，但加強(qiáng)免疫組較一次免疫組的免疫效果好。由此可見，TpI蛋白具有一定的免疫原性，可以作為東畢吸蟲疫苗的候選基因