MiRNAs在早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中的功能研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中miRNAs基因的差異表達芯片分析及相關(guān)靶基因預(yù)測
　　目的:
　　利用基因芯片篩查技術(shù)，篩查早期自發(fā)流產(chǎn)和對照組蛻膜組織中差異表達的miRNAs，并通過相關(guān)靶基因網(wǎng)站查找相關(guān)靶基因，進行生物學(xué)分析。
　　材料和方法:
　　1.收集本院早期妊娠行清宮術(shù)患者的蛻膜組織標(biāo)本，第一時間放入放有Trizol液的小試管中，-80℃液氮保存。

2、>　　2.選取早期自發(fā)流產(chǎn)病例組、正常人流對照組蛻膜組織標(biāo)本各3例，送往北京博奧生物有限公司進行miRNA的表達芯片分析。
　　3.提取各標(biāo)本總RNA，利用miRNA基因芯片篩選早期自發(fā)流產(chǎn)病例組和對照組蛻膜組織中上調(diào)或下調(diào)1.5倍以上差異miRNA進行聚類分析。
　　4.通過miRWalk靶基因預(yù)測網(wǎng)站（DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PIT

3、A、RNA22、TargetScan）對所獲得的有差異表達的miRNAs進行潛在的靶基因預(yù)測。
　　5.DAVID數(shù)據(jù)軟件對差異表達miRNAs中具有血管生成和細胞凋亡功能預(yù)測靶基因進行GO-BP、KEGG功能分析。
　　結(jié)果:
　　1.MiRNAs基因芯片篩查結(jié)果顯示:早期自發(fā)流產(chǎn)子宮蛻膜組織中（差異倍數(shù)為1.5）有70條差異表達miRNAs，其中上調(diào)差異表達miRNAs有32條，下調(diào)差異表達miRNAs有38條。<

4、br>　　2.根據(jù)差異倍數(shù)、在各檢測組織中表達量的不同及相關(guān)文獻，選取上調(diào)差異表達miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p，下調(diào)差異表達miR-378a-3p家族(miR-378a-3p、miR-378c、miR-422a)、miR-378a-5p，通過miRWalk網(wǎng)站查找出和血管生成相關(guān)的上調(diào)miR-125a-5p、miR-29c-3p的共同靶基因VEGFA，和血管生成、細胞侵襲相關(guān)的上調(diào)miR-125a

5、-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p的共同靶基因MMP2;和細胞凋亡相關(guān)的3條下調(diào)miR-378a-3p家族、miR-378a-5p的共同靶基因Caspase10，進行進一步的GO-BP以及KEGG分析。
　　3.上調(diào)差異表達miR-125a-5p、 miR-29c-3p預(yù)測靶基因VEGFA:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:具有糖蛋白、負向調(diào)控細胞凋亡、信號通路、分泌等生物學(xué)功能。
　　2) KEGG分

6、析結(jié)果:通過mTOR信號通路、MAPK信號通路、胰腺癌、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、NOD樣受體信號通路、癌癥路徑起調(diào)控作用。
　　4.上調(diào)差異表達miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193a-5p預(yù)測靶基因MMP2:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:集中在腦部和骨骼的發(fā)育，細胞外基質(zhì)調(diào)控。
　　2) KEGG分析結(jié)果:膀胱癌、癌癥信號通路。
　　5.下調(diào)差異表達miR-378a-3p家族、miR-

7、378a-5p預(yù)測靶基因Caspase10:
　　1) GO-BP分析結(jié)果:集中在細胞凋亡的調(diào)控。
　　2) KEGG分析結(jié)果:Jak-STAT信號通路、慢性粒細胞白血病、Wnt信號通路、T細胞受體通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝信號通路、Hedgehog信號通路、內(nèi)噬作用、丙氨酸天門冬氨酸和谷氨酸代謝信號通路。
　　結(jié)論:
　　1.通過基因芯片檢測初步明確了與早期自發(fā)流產(chǎn)相關(guān)miRNAs的表達譜。
　　2.早期

8、自發(fā)流產(chǎn)脫膜組織中差異表達miRNAs可能通過調(diào)控多個靶基因及多個信號通路參與調(diào)控早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　第二部分 Real-time PCR驗證蛻膜組織中差異表達miRNAs，驗證相關(guān)預(yù)測靶基因的表達
　　目的:
　　利用Real-time PCR技術(shù)，對兩組蛻膜組織中差異表達的基因進行驗證，以確定基因芯片的準(zhǔn)確性;驗證miRNA與各自預(yù)測的靶基因的靶向作用，同時檢測預(yù)測靶基因在對照和EPL患者蛻膜組織中的表達。<

9、br>　　材料和方法:
　　1.Real-time PCR方法檢測對照和EPL組蛻膜組織中差異表達上調(diào)基因miR-125a-5p、miR-29c-3p、miR-193 c-5p和下調(diào)基因miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-378c、miR-422a的表達。
　　2.熒光素酶報告基因驗證miRNAs及相關(guān)靶基因之間的關(guān)系。
　　3.Q-PCR檢測對照和EPL組蛻膜組織中相關(guān)靶基因的mRNA水平，Wes

10、ternblotting檢測其蛋白水平的表達。
　　4.Q-PCR檢測對照、黃體酮治療流產(chǎn)組和EPL組蛻膜組織中miR-378a-3p的表達。
　　結(jié)果:
　　1.Q-PCR結(jié)果顯示EPL組蛻膜組織中，miR-125a-5p、miR-29c-3p和miR-193c-5p相比正常組表達上調(diào)，與基因芯片結(jié)果一致。miR-378a-3p、miR-378c、miR-378a-5p在EPL組中表達下調(diào)，同時miR-378a-3p

11、的差異更具有統(tǒng)計學(xué)意義，而miR-422a的表達沒有變化，與芯片結(jié)果不相符。
　　2.熒光素酶報告基因結(jié)果證實miR-125a-5p、miR-29c-3p的靶基因是VEGFA。miR-125v5p、miR-29c-3p、miR-193c-5p的共同靶基因為MMP2。miR-378a-3p和miR-378c能夠靶向Caspase3。MiR-422a、miR-378a-3p、miRNA-378c和miR-378a-5p均能直接靶向Ca

12、spase10。
　　3.在mRNA水平，預(yù)測的靶基因VEGFA在兩組中的表達無顯著性差異，而預(yù)測的靶基因MMP2在EPL蛻膜表達中有顯著性增加。此外，預(yù)測的靶基因Caspase10、Caspase3在EPL蛻膜表達中有顯著性增加(p＜0.05)。在蛋白水平，EPL蛻膜組織中，VEGFA和MMP2比對照組蛋白表達量下降，而Caspase10和Caspase3比對照組表達量增高(p＜0.05)。
　　4.MiR-378a-3p

13、在黃體酮治療流產(chǎn)組中的相對表達量較EPL組（未用黃體酮治療）升高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.MiR-29c-3p、miR-125a-5p、miR-193a-5p在早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中表達上調(diào)，可能通過調(diào)控靶基因VEGFA和MMP2，影響蛻膜組織的血管生成及滋養(yǎng)細胞侵襲，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　2.MiR-378a-3p家族、miR-378a-5p在早期自發(fā)流產(chǎn)患者蛻膜組織中表達下調(diào)，可能通過調(diào)控

14、細胞凋亡靶基因Caspase3和Caspase10的表達上升，導(dǎo)致蛻膜組織細胞凋亡增加，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　第三部分 MiR-378a-3p通過靶向Caspase10和Caspase3抑制蛻膜細胞凋亡從而調(diào)控早期自發(fā)流產(chǎn)
　　目的:
　　通過體外蛻膜細胞原代培養(yǎng)，進一步研究miR-378a-3p及靶基因Caspase10和Caspase3在早期自發(fā)流產(chǎn)發(fā)生中的作用。
　　材料和方法:
　　1.無菌

15、狀態(tài)下采取正常健康婦女人工流產(chǎn)的蛻膜組織，行體外原代細胞培養(yǎng)，進行組織學(xué)鑒定。
　　2.Q-PCR、Western blotting、免疫組化測定病例組和對照組蛻膜組織中靶基因Caspase10和Caspase3的表達。
　　3.在蛻膜細胞中分別過表達以及干擾miR-378a-3p，檢測靶基因的表達以及蛻膜細胞增殖以及凋亡。
　　4.蛻膜細胞中加入孕激素后，以不同濃度和不同作用時間來檢測miR-378a-3p的表達。<

16、br>　　結(jié)果:
　　1.蛻膜細胞生長好，經(jīng)過兩次傳代到第三代后，鏡下形態(tài)基本均一，DSC數(shù)量達90％以上。
　　2.免疫組化陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示95％的細胞PRL染色呈陽性，且細胞大小形態(tài)均一。染色特點為胞漿內(nèi)細小棕色顆粒，越近細胞核染色越強。證明本實驗所取標(biāo)本確為蛻膜細胞。
　　3.MTT實驗顯示miR-378a-3p能夠影響蛻膜細胞的生長。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-378a-3p mimic48小時后，蛻膜細胞

17、凋亡減弱，與對照組相比有顯著性差異(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染miR-378a-3p inhibitor48小時后，蛻膜細胞凋亡增加，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　5.免疫組化實驗結(jié)果顯示EPL蛻膜組織中，凋亡細胞數(shù)較對照組明顯增加，同時Caspase3的表達比對照組高。
　　6.相同時間(24hr)內(nèi)隨著孕激素濃度增加，miR-378a-3p表達升高，表達有顯著性差異(p＜0.05);孕激素作用時間越長，miR-378a-

18、3p表達上升，有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過體外蛻膜細胞原代培養(yǎng)，進行細胞形態(tài)學(xué)和PRL檢測，建立了體外蛻膜化過程的理想模型，為miRNA的功能研究提供了良好的體外模型。
　　2.早期自發(fā)流產(chǎn)蛻膜組織中miR-378a-3p表達下降，可能通過調(diào)控Caspase3和Caspase10的表達增高，促進蛻膜細胞凋亡增加，參與早期自發(fā)流產(chǎn)的發(fā)生。
　　3.MiR-378a-3p在蛻膜組織中的表達