TRAIL在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程中的功能研究.pdf

1、胚胎著床是胎生哺乳動物及人類生殖的重要環(huán)節(jié)，胚胎著床的關鍵步驟是胚胎滋養(yǎng)層細胞對子宮內(nèi)膜的侵入。滋養(yǎng)層細胞與子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞之間的“對話”精確地調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的增殖分化和子宮內(nèi)膜的蛻膜化。蛻膜是子宮內(nèi)膜基質(zhì)受蛻膜化誘導因子的刺激而增殖和再分化形成的一種特殊組織，它對妊娠的建立和維持至關重要。在小鼠，胚胎粘附誘導上皮下基質(zhì)細胞增殖、分化為成熟的蛻膜細胞，并逐漸向周圍擴展，形成的蛻膜細胞又依照同樣的方向不斷退化和死亡，并被鄰近的滋

2、養(yǎng)層細胞或巨噬細胞吞噬。蛻膜細胞的增殖和退化同時并存，二者在動態(tài)平衡中協(xié)調(diào)蛻膜細胞的數(shù)量和滋養(yǎng)層細胞的侵入?，F(xiàn)己表明，蛻膜細胞的增殖與退化是一個涉及多種因素的細胞凋亡過程。鑒于該過程與腫瘤侵襲過程的相似性，其涉及的調(diào)控機制也是目前生殖領域研究的熱點。
　　 在諸多參與細胞凋亡的因子中，腫瘤壞死因子TNF是誘導細胞凋亡的一類重要的細胞因子，TRAIL（TNF-related apoptosis-inducing ligand）作為

3、其家族成員是近幾年腫瘤預防和治療領域的研究熱點之一。本實驗室在前期的小鼠子宮免疫組化時發(fā)現(xiàn)，TRAIL在植入前的子宮上皮及植入后蛻膜細胞的表達呈現(xiàn)出很強的時空特異性，并且此期間TRAIL特異的凋亡受體MK（Mouse Killer），的表達也呈相互配合的趨勢，這提示TRAIL信號可能與小鼠植入后蛻膜細胞的凋亡有密切關系，可能參與了妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化的進程。
　　 基于前期試驗結果，本試驗采用基因工程技術、細胞原代培養(yǎng)、Wes

4、tern blotting、免疫細胞化學、流式細胞術、熒光定量PCR以及宮角注射等方法初步探討TRAIL對妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程的作用及其分子機理。該研究將為闡明胚胎著床的分子機理補充新的證據(jù)，同時也為胚胎植入與腫瘤侵襲的比較研究提供新的視野。
　　 第一部分、 TRAIL在小鼠子宮蛻膜細胞中的表達
　　 目的：篩選分離提取小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的最佳方法，了解原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的生長特性，分析基質(zhì)細胞誘導

5、蛻膜化之后TRAIL mRNA及蛋白的表達情況。
　　 方法：胰酶消化法和混合酶消化法分離提取并培養(yǎng)妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞，采用細胞免疫熒光技術檢測波形蛋白的表達對其純度進行鑒定，通過檢測細胞貼壁率找出基質(zhì)細胞生長所需的最適pH，采用MTT試驗繪制生長曲線，找到其對數(shù)生長期，最后用孕酮、雌二醇和cAMP誘導基質(zhì)細胞蛻膜化，RT-PCR和Western blotting分別檢測不同時間點TRAIL mRNA及蛋白的表達。

6、　　 結果：1.相對于混合酶消化法，胰酶消化法成本低，省時省力，且提取培養(yǎng)的原代妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞數(shù)量多，純度較高，達到（95.8±0.3）％；2.基質(zhì)細胞生長的最適pH值為7.0，原代培養(yǎng)12-48h為其對數(shù)生長期，48h后即進入平臺期；3.小鼠子宮基質(zhì)細胞在誘導蛻膜化后，TRAIL mRNA及蛋白的表達隨時間增長而顯著升高（p<0.05）。
　　 結論：成功篩選出高效可行、簡單實用的基質(zhì)細胞原代培養(yǎng)方法，并初步了解基

7、質(zhì)細胞的生長特性，同時對基質(zhì)細胞進行蛻膜化誘導后，發(fā)現(xiàn)TRAIL在蛻膜化過程中有特異的表達變化。
　　 第二部分、卵巢激素對小鼠子宮中TRAIL基因表達的調(diào)控
　　 目的：探討孕酮、雌二醇是否對TRAIL基因在小鼠子宮的表達具有調(diào)控作用。
　　 方法：將去卵巢小鼠隨機分為4組，每組3只：1.孕酮組，0.2mg/mouse；2.雌二醇組，100ng/mouse；3.孕酮+雌二醇組，劑量同前；4.對照組，芝麻油0.1

8、ml/mouse。分別于皮下注射后0h、6h、12h、24h取各組小鼠子宮，采用熒光定量PCR對TRAIL mRNA的水平進行檢測，同時用Western blotting檢測其蛋白表達水平的變化。
　　 結果：孕酮和雌二醇均能顯著提高TRAIL mRNA和蛋白在小鼠子宮中的表達，且表現(xiàn)為時間依賴性，隨時間增長TRAIL mRNA和蛋白的表達顯著增加（p<0.05），孕酮和雌二醇聯(lián)合使用時，調(diào)控作用有一定的疊加效應（p<0.05）

9、。
　　 結論：TRAIL基因在小鼠子宮中的表達受到孕酮、雌二醇的正向調(diào)節(jié)。
　　 第三部分、 TRAIL對小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程的功能研究
　　 第一節(jié) TRAIL過表達質(zhì)粒的構建
　　 目的：構建TRAIL過表達質(zhì)粒，為研究TRAIL基因的功能提供工具。
　　 方法：通過設計兩條分別帶有SalⅠ和MluⅠ酶切位點的PCR引物，將TRAIL的全長cDNA序列作為目的序列克隆入pSEB-HUS載體

10、，即pSEB-HUS-TRAIL。通過菌液PCR檢測、Sα/Ⅰ和MluⅠ雙酶切鑒定和測序驗證質(zhì)粒構建是否正確。菌液Western blotting檢測pSEB-HUS-TRAIL在菌液中是否表達TRAIL蛋白。
　　 結果：成功構建TRAIL基因的過表達質(zhì)粒pSEB-HUS-TRAIL。
　　 第二節(jié) TRAIL干擾質(zhì)粒的構建
　　 目的：構建、篩選針對TRAIL基因的干擾質(zhì)粒，為后續(xù)試驗做準備。
　　

11、方法：設計、合成4條靶向TRAIL基因的干擾序列，將干擾序列克隆到SfiⅠ酶切后的pSEB-HUS-TRAIL質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化DH5α后進行菌液PCR和質(zhì)粒測序，分別命名為SipSEB-TRAIL1、 SipSEB-TRAIL2、SipSEB-TRAIL3、SipSEB-TRAIL4。將4個干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，選擇72h后GFP熒光最弱的干擾質(zhì)粒用PacⅠ酶切除去TRAIL基因后自連，即為篩選出的TRAIL干擾質(zhì)粒。

12、　　 結果：成功構建、篩選出SipSEB-TRAIL3為TRAIL基因干擾質(zhì)粒。
　　 第三節(jié) TRAIL對小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程的影響
　　 目的：觀察過表達及干擾TRAIL對小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細胞增殖、細胞周期、凋亡及蛻膜化進程的影響，以及對在體蛻膜化進程的影響。
　　 方法：TRAIL過表達或干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠基質(zhì)細胞后誘導蛻膜化發(fā)生，于轉(zhuǎn)染后72h時，通過RT-PCR及Western blotting評

13、價其轉(zhuǎn)染TRAIL過表達及干擾質(zhì)粒后增強或抑制TRAIL表達的效應。通過MTT法觀察蛻膜基質(zhì)細胞的生長和增殖能力，流式細胞術檢測蛻膜基質(zhì)細胞的細胞周期分布和凋亡率，Western blotting檢測催乳素蛋白表達的變化情況。過表達和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞后收集逆轉(zhuǎn)錄病毒并測定滴度。通過宮角注射分別給予妊娠d3.5小鼠TRAIL過表達和干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒，d7和d8時取蛻膜組織進行稱重，同時統(tǒng)計植入點數(shù)目。
　　 結果：TRAIL過

14、表達質(zhì)粒能夠上調(diào)蛻膜基質(zhì)細胞中TRAIL mRNA及蛋白的表達，干擾質(zhì)粒能有效地抑制TRAIL mRNA及蛋白的表達（p<0.05）。在體外，TRAIL過表達使蛻膜基質(zhì)細胞被阻滯在G0/G1期、抑制蛻膜基質(zhì)細胞增殖并促使其凋亡，催乳素表達降低，而干擾TRAIL促進蛻膜細胞的增殖，減少了蛻膜細胞的凋亡，催乳素表達升高。體內(nèi)宮角注射逆轉(zhuǎn)錄病毒，過表達TRAIL使蛻膜組織重量降低，干擾TRAIL使蛻膜組織重量增加，過表達和干擾TRAIL后小鼠

15、子宮植入位點均顯著減少。
　　 結論：過表達TRAIL抑制妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進程，干擾TRAIL促進妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的蛻膜化進程，但二者均造成植入胚胎數(shù)量的下降，其原因可能是破壞了子宮內(nèi)膜蛻膜基質(zhì)細胞增殖與凋亡的平衡。
　　 第四節(jié) TRAIL影響小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程的分子機理
　　 目的：初步探討TRAIL影響妊娠小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進程的分子機理。
　　 方法：RT-PCR檢測妊娠小鼠子宮內(nèi)膜基

16、質(zhì)細胞誘導蛻膜化后，TRAIL受體DcR1、DcR2和MK的mRNA表達?；|(zhì)細胞轉(zhuǎn)染TRAIL過表達質(zhì)粒后誘導其蛻膜化，Western blotting檢測pro-caspase-8及Bcl-2的蛋白的表達。
　　 結果：DcR1 mRNA在誘導基質(zhì)蛻膜化72h升高顯著（p<0.05），DcR2mRNA隨時間變化不顯著（p>0.05），MK mRNA的表達隨誘導蛻膜化時間的增長而顯著升高，且表達量在24h時達到高峰（p<0.0

17、5）?；|(zhì)細胞轉(zhuǎn)染TRAIL過表達質(zhì)粒72h后的pro-caspase-8及Bcl-2蛋白水平顯著降低（p<0.05）。
　　 結論：蛻膜基質(zhì)細胞中TRAIL過表達會引起細胞凋亡水平提高，相反，干擾TRAIL表達使細胞凋亡水平降低，推測小鼠子宮蛻膜細胞中TRAIL主要通過與膜受體MK結合引起pro-caspase-8活化為caspase-8，同時下調(diào)Bcl-2表達而通過線粒體依賴途徑誘導蛻膜基質(zhì)細胞的凋亡。
　　 綜上所