核仁因子Bms1l在斑馬魚肝臟發(fā)育過(guò)程中的功能研究.pdf

1、肝臟的發(fā)生和發(fā)育是一個(gè)受到精密調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。人們利用模式生物的研究已經(jīng)逐漸了解了肝臟細(xì)胞的起源、形態(tài)發(fā)生及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，也鑒定出了一些參與肝臟發(fā)育的重要因子。作為一種研究胚胎早期發(fā)育理想的模式生物，斑馬魚受到了越來(lái)越多研究人員的關(guān)注，尤其是結(jié)合目前迅速發(fā)展的CRISPR-Cas9等技術(shù)，使得相關(guān)的研究手段更加多樣、層次更加深入。
　　本課題綜合利用遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究方法，以斑馬魚為模式生物，系統(tǒng)研究

2、了bms1l基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用。通過(guò)ENU化學(xué)誘變篩選小肝臟表型的斑馬魚，我們課題組獲得了一個(gè)bms1l基因突變的斑馬魚品系bms1lsq163。研究顯示在bms1lsq163突變體中，bms1l基因第5外顯子發(fā)生了T到A的堿基突變，從而導(dǎo)致bms1l第154位密碼子從亮氨酸(CTG)置換為谷氨酰胺密碼(CAG)。相關(guān)表型分析發(fā)現(xiàn)bms1 lsq163突變體中，包括肝臟、外分泌胰腺和腸道在內(nèi)的消化器官生長(zhǎng)發(fā)育受到特異性

3、的阻滯。進(jìn)一步研究顯示，肝臟在早期起始和分化階段并沒(méi)有受到影響。為了深入驗(yàn)證bms1l在肝臟發(fā)育過(guò)程中的重要作用，我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)對(duì)bms1l基因進(jìn)行敲除，從而獲得了另一個(gè)品系的突變體bms1lzju1。在該突變體中，bms1l基因第2個(gè)外顯子上有13個(gè)堿基的插入，從而破壞了蛋白的正常編碼。由于Bms1l蛋白的完全缺失，bms1lzju1突變體有著更為嚴(yán)重的消化器官生長(zhǎng)發(fā)育缺陷。我們?cè)赽ms1 lsq163和bms1l

4、zju1兩個(gè)等位基因突變體的基礎(chǔ)上深入研究了Bms1l在斑馬魚肝臟發(fā)育過(guò)程中的功能。
　　前人在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)Bmsl是一個(gè)核仁蛋白并且能與Rcl1蛋白形成復(fù)合物，共同參與核糖體前體RNA(pre-rRNA)的加工剪切。因此，Bms1對(duì)18S rRNA的成熟及核糖體生成有重要作用。根據(jù)以上研究，我們想了解斑馬魚中的同源基因bms1l是否有這些保守的功能。首先，通過(guò)免疫熒光共定位及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Bms1l和Rcl1都是核

5、仁蛋白并且能夠互作，同時(shí)也用人的這兩個(gè)蛋白進(jìn)一步驗(yàn)證了該功能的保守性。其次，我們發(fā)現(xiàn)bms1lsq163和bms1lzju1突變體中pre-rRNA的加工過(guò)程和18S rRNA的生成均受到了影響，說(shuō)明Bms1l確實(shí)在其中行使重要功能。另外，突變體肝臟細(xì)胞的核仁由于受到異常的pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工影響，其形態(tài)也發(fā)生了明顯的改變。
　　在上述研究過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)bms1l突變體核仁中rDNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，這使得與轉(zhuǎn)錄方向相反

6、的DNA復(fù)制又受到嚴(yán)重阻滯，進(jìn)而引起了DNA損傷反應(yīng)。我們?cè)敿?xì)研究了其中的P53信號(hào)通路，結(jié)果顯示在bms1l突變體中，P53及其異構(gòu)體的表達(dá)水平顯著提高，并且受P53調(diào)控的下游基因表達(dá)也被激活。由于P53的活化能夠抑制細(xì)胞周期的進(jìn)行，我們?cè)赑53突變的背景下分析了bms1lsq163突變體中消化器官的拯救情況。結(jié)果顯示該雙重突變體能夠部分拯救小肝臟和小胰腺的表型。
　　接著，我們?cè)敿?xì)分析了bms1lsq163突變體的肝臟細(xì)胞在細(xì)

7、胞周期中具體受阻滯的時(shí)期。結(jié)合細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白免疫熒光和Edu摻入實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)突變體中處于S期DNA復(fù)制階段的肝臟細(xì)胞比例顯著上升，相應(yīng)地，G2期至M期的比例顯著下調(diào)。通過(guò)Edu和Brdu不同時(shí)間點(diǎn)的雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)，我們進(jìn)一步驗(yàn)證了bms1l突變體的肝臟細(xì)胞中存在旺盛的DNA復(fù)制現(xiàn)象，從而使得肝臟中非整倍體和多倍體細(xì)胞的比例上升。
　　綜合上述在bms1lsq163和bms1lzju1突變體中的研究，我們不僅驗(yàn)證了Bms1l是一個(gè)功能