bock1在斑馬魚胚胎頭部后腦血管發(fā)育中的功能研究.pdf

1、bock1是一個(gè)新型的膜結(jié)合天冬氨酸蛋白酶，是由501個(gè)氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，bock1基因能調(diào)節(jié)髓鞘形成，其在正常神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中也起著關(guān)鍵作用。但是關(guān)于bock1斑馬魚體內(nèi)的性質(zhì)和功能方面的研究開展得仍然相當(dāng)有限，其與人類和老鼠中表達(dá)部位不一致，而導(dǎo)致暫時(shí)無(wú)法預(yù)測(cè)其可能存在的底物和參與的代謝途徑。
　　血管生長(zhǎng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，它是在原有血管的基礎(chǔ)上出芽、遷移形成新的血管。因此這個(gè)過程與許多血管相關(guān)的疾病有密切關(guān)

2、系，此外血管生成對(duì)胚胎的發(fā)育也起著至關(guān)重要的作用。其中頭部血管系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，其對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生存和發(fā)育都是必須的，對(duì)于腦中風(fēng)及其他的大腦疾病影響也非常巨大。頭部血管的形成是可再生的，它的形成模式遵循一定的規(guī)律。斑馬魚的心血管系統(tǒng)在基因水平上85％與人類同源，早期發(fā)育與人類也極為相似。因此利用斑馬魚研究血管發(fā)育過程，及參與其中的重要因子的作用，可以為臨床醫(yī)學(xué)提供很好的理論基礎(chǔ)。
　　近年來(lái)，血管形成發(fā)育及再生的分子機(jī)制研究

3、取得了許多突破性進(jìn)展。在生物體中，神經(jīng)與血管一般都相伴相生，二者形成相似的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而研究也表明，血管網(wǎng)絡(luò)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成有許多共同的分子機(jī)制參與其中，二者相互調(diào)控。而在雞和斑馬魚的研究中將更多的分子信號(hào)途徑與血管網(wǎng)絡(luò)形成及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成偶聯(lián)起來(lái)。
　　在本課題研究中，我們首先克隆出斑馬魚的bock1基因，通過全胚胎原位雜交對(duì)其在斑馬魚胚胎發(fā)育的不同時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)bock1在斑馬魚體內(nèi)主要表達(dá)在頭部。然后利用斑馬魚轉(zhuǎn)

4、基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，紅色熒光蛋白(DsRed)標(biāo)記血細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)，在1-2個(gè)細(xì)胞時(shí)期注射特異性的嗎啡林（morpholinos）修飾性寡核苷酸，并通過共聚焦顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)變化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲降內(nèi)源性bock1之后，頭部血管叢在36hpf發(fā)生明顯的缺陷，尤其是腦血管BA和CtAs的形成缺陷。這些缺陷可以通過注射bock1mRNA被部分回救。其次注射boc

5、k1mRNA于胚胎中，觀察過表達(dá)bock1的表型發(fā)現(xiàn)，斑馬魚全身的血管形成分枝增多，形成模式有一定程度的紊亂。
　　血管網(wǎng)絡(luò)與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成有許多共同的分子機(jī)制參與其中，二者相互調(diào)控。bock1基因能調(diào)節(jié)髓鞘形成，組成髓鞘的施旺細(xì)胞能分泌VEGF使得動(dòng)脈血管沿著神經(jīng)纖維分布。而VEGF對(duì)于頭部后腦血管血管的出芽也有著重要的作用。因此利用標(biāo)記與VEGF信號(hào)相關(guān)的的分子探針vegfa，vegfc、flt4，dll4，和組成髓鞘的施旺細(xì)

6、胞相關(guān)的分子探針gfap進(jìn)行全胚胎原位雜交，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)vegfa、flt4、dll4和gfap在敲降內(nèi)源性bock1基因的胚胎中表達(dá)均下調(diào);在共注射bock1MO和vegfamRNA的胚胎中發(fā)現(xiàn)，vegfamRNA能部分回救敲降bock1對(duì)頭部血管造成的表型。結(jié)果表明，bock1基因影響頭部后腦的血管發(fā)育，且該過程可能與VEGF信號(hào)有關(guān)，主要通過施旺細(xì)胞介導(dǎo)，通過vegfa起作用。
　　隨后，為了進(jìn)一步對(duì)bock1與vegfa相互作

7、用機(jī)制進(jìn)行深入研究，我們對(duì)bock1具體表達(dá)的組織進(jìn)行進(jìn)一步定位。首先利用斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(flk1:GFP×gata1:DsRed)，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，紅色熒光蛋白(DsRed)標(biāo)記血細(xì)胞。收集其30hpf的斑馬魚胚胎的頭部，通過流式細(xì)胞儀分選出頭部的綠色熒光細(xì)胞和紅色熒光細(xì)胞，檢測(cè)bock1在血管或者血液中是否有表達(dá)。但在隨后的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，并不能擴(kuò)增出bock1特異性的條帶，證明bock1并不在血管和