Clostridium absonum 7α-羥基類固醇脫氫酶輔酶結合區(qū)關鍵殘基的功能研究.pdf

1、羥基類固醇脫氫酶（Hydroxysteroiddehydrogenase，HSDH）在膽汁酸類物質轉化、甾體激素轉化、膽固醇代謝、非甾體類醛、酮和醌羰基還原等過程中發(fā)揮著重要作用，同時，在工業(yè)生物催化方面也具有較大的應用潛力。本文以Clostridiumabsonum7α-HSDH（CA7α-HSDH）為研究對象，利用基因工程手段對CA7α-HSDH的輔酶結合位點進行改造，進一步應用分子動力學模擬分析酶與輔酶的作用細節(jié)，闡明CA7α-H

2、SDH輔酶結合區(qū)關鍵殘基的功能。
　　主要研究內容和結果如下：
　?。?）在GST標簽融合表達的基礎上，本文進一步探索了CA7α-HSDH關于pTWIN1載體的表達，成功構建了CA7α-HSDH/pTWIN1表達系統(tǒng)，獲取了有良好活性的CA7α-HSDH，該表達方式的構建為降低CA7α-HSDH的獲取成本，推動工業(yè)應用提供了一定基礎。
　?。?）通過對三維結構分析，運用定點突變技術，對CA7α-HSDH的輔酶結合位點進

3、行改造，成功獲得了7個突變體T15A、R16A、R38A、R194A、R16A/R194A、R38A/R194A、T15A/R16A/R194A。酶促動力學研究顯示，①成功獲得了活性提高的R16A和R194A突變體，相比于野生型酶活性分別提高1.8倍和4.8倍。二者催化常數（kcat）和米氏常數（Km）均增大，R16A的催化效率（kcat/Km）下降了16.2％，而R194A的催化效率（kcat/Km）增大3倍。②T15A、R16A/R

4、194A和T15A/R16A/R194A三個突變體同野生型酶相比，酶活性分別下降了26.8%、55.2%、75.9%。三者催化常數（kcat）降低，米氏常數（Km）增大，催化效率（kcat/Km）分別下降了81.8%、43.4%、84.6%。③R38A、R38A/R194A兩個突變體未檢測到活性，初步推測R38的作用較為關鍵。④從酶促動力學參數發(fā)現，保持功能的突變體Km和單點突變體的kcat均增大，推測T15、R16、R194的作用體現

5、在酶與輔酶間親和力和催化速度方面，相應的，T15和R194分別在維持親和力和轉化底物速度方面有較為突出的貢獻。
　?。?）運用MD模擬技術，對上述突變體與輔酶作用的細節(jié)進行了研究。①結合自由能計算結果顯示，與野生型相比，七個突變體與NADP+的結合自由能顯著上升，這與酶促動力學實驗測得的結果——突變體酶對NADP+的親和力下降相符。②對R38A和R38A/R194A突變體分析發(fā)現，陽離子-π作用消失，表明突變體與輔酶的作用模式的改

6、變破壞了NADPH與酶的結合，是突變體失去活性的原因；T15A、R16A、R194A、R16A/R194A、T15A/R16A/R194A這五個突變體未影響R38與輔酶的陽離子-π作用，因而仍然保持生物功能，與酶活實驗結果相符，由此表明R38在CA7α-HSDH與輔酶II結合過程中具有關鍵作用。③將T15、R16、R194單點突變?yōu)楸彼岷螅》葴p弱磷酸基團周圍的正電量，T15、R16、R194與2位磷酸基團的氫鍵作用消失，由此表明，

7、由T15、R16、R194介導的與磷酸基的氫鍵將直接影響酶與輔酶間親和力，且親和力具有一定的最適范圍，在該范圍內，適當的減弱親和力有利于酶活、催化效率的提高；另外，將R194突變?yōu)楸彼岷螅琑194與焦磷酸橋的氫鍵作用全部消失，導致焦磷酸橋柔性增大，處于反應中心的煙酰胺環(huán)運動/解離容易，整體反應速度加快，這與突變實驗結果kcat值增加是相符的。④聯合突變體R16A/R194A和T15A/R16A/R194A中，逐步提高正電量的減少程度，