乙醛脫氫酶基因克隆及酶功能研究.pdf

1、人肝臟線粒體乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase2,ALDH2)能催化乙醛氧化為乙酸,在人體乙醛解毒方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而且,在心絞痛、心肌梗塞和心力衰竭的治療中,ALDH2也起重要的催化功能,使硝化甘油轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和1,2-二硝酸甘油。因此,在將來(lái)的臨床治療中人ALDH2會(huì)有重要應(yīng)用。
　　 本論文克隆了人的ALDH2*1 cDNA,并在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá),對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。為比較不同物種

2、ALDH的性質(zhì)和功能的區(qū)別,還篩選了兩株ALDH活性較高的菌株,克隆了一株細(xì)菌中與人ALDH2很類(lèi)似的輔酶NAD+依賴(lài)型ALDH基因,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并對(duì)重組酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究,探討了其功能。
　　 選用畢赤酵母Pichia pastoris GS115表達(dá)人ALDH2。基于ALDH2*1 cDNA序列信息,通過(guò)選擇畢赤酵母偏好的密碼子和降低序列GC含量對(duì)ALDH2 cDNA序列進(jìn)行了改造。設(shè)計(jì)好的序列利用重疊延伸

3、PCR技術(shù)進(jìn)行了人工合成。然后將該cDNA克隆到質(zhì)粒pPIC9K中,重組載體電轉(zhuǎn)化至P.pastoris GS115中,構(gòu)建重組菌株。該重組菌株在三角瓶中培養(yǎng)后,發(fā)酵液中的分泌蛋白量為80mg/L,而含有原始人ALDH2*1cDNA的重組菌株在三角瓶中培養(yǎng)得到的重組蛋白產(chǎn)量?jī)H為16mg/l。
　　 對(duì)重組菌株進(jìn)行了進(jìn)一步的搖瓶表達(dá)條件優(yōu)化和發(fā)酵罐發(fā)酵研究。搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件是:25℃低溫培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY的起始pH7.

4、0、誘導(dǎo)初始菌體密度為干重4.5g/L、誘導(dǎo)表達(dá)60h、誘導(dǎo)過(guò)程中每24h補(bǔ)甲醇濃度為1.2％(v/v)。高密度發(fā)酵基本工藝是:甘油做碳源培養(yǎng)階段,初始甘油濃度為40g/L,培養(yǎng)約23h后甘油耗盡,按9-11mL/L/h流加500ml含有50％甘油和1.2％(v/v)PTM1微量鹽的溶液。流加結(jié)束后,菌體濃度達(dá)74g/L干重。饑餓1h左右,然后開(kāi)始甲醇流加,甲醇流加量逐漸從1mL/L/h提高至約15mL/L/h,并與溶解氧關(guān)聯(lián)。整個(gè)發(fā)酵

5、過(guò)程溶氧均控制不低于20％。誘導(dǎo)表達(dá)72 h后,收集培養(yǎng)液上清,分泌蛋白的量大約是每升發(fā)酵液260mg,重組蛋白純化后ALDH2的比酶活是1.2 U/mg。
　　 對(duì)前述發(fā)酵液中分離純化的重組蛋白在解救小鼠急性酒精中毒中的作用進(jìn)行了初步研究,檢測(cè)了小鼠的醉酒時(shí)間和醒酒時(shí)間,以及肝臟和血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給小鼠灌酒之前用人ALDH2或用ADH和人ALDH2混合酶液灌胃可以延緩小鼠的醉酒,并加快其醒酒:灌胃

6、人ALDH2的小鼠和灌胃ADH與人ALDH2混合液的小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于沒(méi)給藥的小鼠,并且僅略高于空白對(duì)照組的正常小鼠。表明該重組人ALDH2具有明顯解酒效果,且對(duì)小鼠的肝臟起到了一定保護(hù)作用。上述研究為下一步乙醇和乙醛解毒產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 從土壤中篩選得到了ALDH酶活性較高的兩個(gè)菌株,該菌株在含誘導(dǎo)劑0.7％乙醇的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好并顯示較高的ALDH酶活性。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果和核酸序列分析

7、鑒定均為不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter菌株,并發(fā)現(xiàn)16-23S rDNA間隔序列可有效用于不動(dòng)桿菌的分類(lèi)鑒定。克隆得到了Acinetobacter sp.HBS-2的輔酶NAD+依賴(lài)型ALDH基因,基因全長(zhǎng)1467 bp,分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個(gè)未曾報(bào)道的基因。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中,并在E.coli BL21中進(jìn)行了表達(dá)。重組蛋白的性質(zhì)明顯區(qū)別于已報(bào)道的微生物的ALDH,錳離子對(duì)該重組酶有較強(qiáng)激活作用。將根據(jù)

8、基因序列推知的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸殘基序列在GenBank中進(jìn)行了BLAST分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的一級(jí)序列與A.baumannii17978菌株中與致病有關(guān)的ALDH高度相同,且與人肝臟線粒體依賴(lài)NAD+的ALDH2的保守序列高度一致。推測(cè)該菌株有兩種以上依賴(lài)NAD+的ALDH基因和蛋白質(zhì),乙醇氧化和乙醇介導(dǎo)的致病途徑可能是由不同的ALDH催化的,本研究克隆得到的基因產(chǎn)物可能與該菌株的致病性有關(guān)。本研究為今后有關(guān)乙醇的信號(hào)途徑及ALDH參