乙醛脫氫酶基因克隆及酶功能研究.pdf

1、人肝臟線粒體乙醛脫氫酶2(acetaldehyde dehydrogenase2,ALDH2)能催化乙醛氧化為乙酸,在人體乙醛解毒方面有潛在的應(yīng)用價值。而且,在心絞痛、心肌梗塞和心力衰竭的治療中,ALDH2也起重要的催化功能,使硝化甘油轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和1,2-二硝酸甘油。因此,在將來的臨床治療中人ALDH2會有重要應(yīng)用。
　　 本論文克隆了人的ALDH2*1 cDNA,并在畢赤酵母中進行表達(dá),對其功能進行了初步研究。為比較不同物種

2、ALDH的性質(zhì)和功能的區(qū)別,還篩選了兩株ALDH活性較高的菌株,克隆了一株細(xì)菌中與人ALDH2很類似的輔酶NAD+依賴型ALDH基因,在大腸桿菌中進行表達(dá),并對重組酶的基本酶學(xué)性質(zhì)進行了研究,探討了其功能。
　　 選用畢赤酵母Pichia pastoris GS115表達(dá)人ALDH2?；贏LDH2*1 cDNA序列信息,通過選擇畢赤酵母偏好的密碼子和降低序列GC含量對ALDH2 cDNA序列進行了改造。設(shè)計好的序列利用重疊延伸

3、PCR技術(shù)進行了人工合成。然后將該cDNA克隆到質(zhì)粒pPIC9K中,重組載體電轉(zhuǎn)化至P.pastoris GS115中,構(gòu)建重組菌株。該重組菌株在三角瓶中培養(yǎng)后,發(fā)酵液中的分泌蛋白量為80mg/L,而含有原始人ALDH2*1cDNA的重組菌株在三角瓶中培養(yǎng)得到的重組蛋白產(chǎn)量僅為16mg/l。
　　 對重組菌株進行了進一步的搖瓶表達(dá)條件優(yōu)化和發(fā)酵罐發(fā)酵研究。搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件是:25℃低溫培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY的起始pH7.

4、0、誘導(dǎo)初始菌體密度為干重4.5g/L、誘導(dǎo)表達(dá)60h、誘導(dǎo)過程中每24h補甲醇濃度為1.2％(v/v)。高密度發(fā)酵基本工藝是:甘油做碳源培養(yǎng)階段,初始甘油濃度為40g/L,培養(yǎng)約23h后甘油耗盡,按9-11mL/L/h流加500ml含有50％甘油和1.2％(v/v)PTM1微量鹽的溶液。流加結(jié)束后,菌體濃度達(dá)74g/L干重。饑餓1h左右,然后開始甲醇流加,甲醇流加量逐漸從1mL/L/h提高至約15mL/L/h,并與溶解氧關(guān)聯(lián)。整個發(fā)酵

5、過程溶氧均控制不低于20％。誘導(dǎo)表達(dá)72 h后,收集培養(yǎng)液上清,分泌蛋白的量大約是每升發(fā)酵液260mg,重組蛋白純化后ALDH2的比酶活是1.2 U/mg。
　　 對前述發(fā)酵液中分離純化的重組蛋白在解救小鼠急性酒精中毒中的作用進行了初步研究,檢測了小鼠的醉酒時間和醒酒時間,以及肝臟和血液中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給小鼠灌酒之前用人ALDH2或用ADH和人ALDH2混合酶液灌胃可以延緩小鼠的醉酒,并加快其醒酒:灌胃

6、人ALDH2的小鼠和灌胃ADH與人ALDH2混合液的小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著低于沒給藥的小鼠,并且僅略高于空白對照組的正常小鼠。表明該重組人ALDH2具有明顯解酒效果,且對小鼠的肝臟起到了一定保護作用。上述研究為下一步乙醇和乙醛解毒產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 從土壤中篩選得到了ALDH酶活性較高的兩個菌株,該菌株在含誘導(dǎo)劑0.7％乙醇的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長良好并顯示較高的ALDH酶活性。生理生化實驗結(jié)果和核酸序列分析

7、鑒定均為不動桿菌屬Acinetobacter菌株,并發(fā)現(xiàn)16-23S rDNA間隔序列可有效用于不動桿菌的分類鑒定?？寺〉玫搅薃cinetobacter sp.HBS-2的輔酶NAD+依賴型ALDH基因,基因全長1467 bp,分析發(fā)現(xiàn)該基因是一個未曾報道的基因。將該基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中,并在E.coli BL21中進行了表達(dá)。重組蛋白的性質(zhì)明顯區(qū)別于已報道的微生物的ALDH,錳離子對該重組酶有較強激活作用。將根據(jù)

8、基因序列推知的表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸殘基序列在GenBank中進行了BLAST分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的一級序列與A.baumannii17978菌株中與致病有關(guān)的ALDH高度相同,且與人肝臟線粒體依賴NAD+的ALDH2的保守序列高度一致。推測該菌株有兩種以上依賴NAD+的ALDH基因和蛋白質(zhì),乙醇氧化和乙醇介導(dǎo)的致病途徑可能是由不同的ALDH催化的,本研究克隆得到的基因產(chǎn)物可能與該菌株的致病性有關(guān)。本研究為今后有關(guān)乙醇的信號途徑及ALDH參