長梗木霉外切纖維素酶基因的克隆及其表達(dá).pdf

1、本研究對(duì)一株纖維素酶高產(chǎn)菌株XST1進(jìn)行ITS分子標(biāo)記鑒定，接著克隆了該菌的兩個(gè)外切纖維素酶基因cbh I和cbh II，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了外切纖維素酶基因在畢赤酵母中的有效表達(dá)。外切纖維素酶基因的克隆及其表達(dá)，豐富了現(xiàn)有的纖維素酶基因資源，也為該基因的進(jìn)一步改造奠定了初步的分子基礎(chǔ)。主要的研究?jī)?nèi)容和成果包括： (1)XST1菌株的分子鑒定：克隆并測(cè)定XST1菌株的ITS序列，通過比對(duì)和聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明該菌株與長梗木

2、霉(Trichodermalongibrachiatum)親緣關(guān)系最為緊密，初步鑒定為長梗木霉。 (2)外切纖維素酶的基因組DNA和cDNA的克隆及序列分析：提取XST1的基因組DNA和總RNA，參照里氏木霉和綠色木霉相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR和RT-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增了外切纖維素酶I、II的全長基因序列和cDNA序列。序列分析結(jié)果表明：cbh I基因長1681 bp，含2個(gè)內(nèi)含子(462-527 bp和1226-1294

3、 bp)；cbh II基因全長1583 bp，含3個(gè)內(nèi)含子(93-143 bp、528-583bp和832-894bp)。 (3)基因工程菌的構(gòu)建：將cbh-cDNA序列插入表達(dá)載體pPIC3.5K，通過電擊轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入畢赤酵母GS115菌株。重組菌株經(jīng)0.5％甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了外切纖維素酶蛋白的分泌表達(dá)。SDS-PAGE分析表明，表達(dá)的酶蛋白分子量約為65kDa和67kDa左右。CMC檢測(cè)平板中出現(xiàn)透明水解圈，工程菌發(fā)酵上

4、清液水解CMC的最大酶活分別為26.40 U/mL和24.70 U/mL，水解pNPC的最大酶活分別為28.89 U/L和26.39 U/L。纖維素酶廣泛應(yīng)用于食品、飼料、服裝紡織、洗滌、造紙等工業(yè)領(lǐng)域中。在纖維素燃料乙醇的生產(chǎn)中，纖維素酶具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)前景。但應(yīng)用天然微生物生產(chǎn)纖維素酶存在許多問題，如各酶組分比例不合理、酶產(chǎn)量低、活性低、質(zhì)量不穩(wěn)定等，這些問題都極大的影響了纖維素酶的生產(chǎn)和應(yīng)用，因此亟需尋找新的菌種資源或?qū)ζ?/p>

5、進(jìn)行改造，以提高纖維素酶的使用效果，拓展其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。目前對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的研究多集中在真菌的木霉屬，其中里氏木霉(Trichoderma reesei)、康寧木霉(Trichoderma koningii)等研究的最為透徹，對(duì)長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)的研究則很少見報(bào)道。 本研究首先對(duì)一株纖維素酶高產(chǎn)菌株XST1進(jìn)行分子鑒定，采用CTAB法提取該菌的菌絲體總DNA，設(shè)計(jì)真菌IT

6、S序列通用引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，將回收片段連接到pMD18-T simple載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，應(yīng)用氨卞抗性平板篩選陽性克隆子，然后送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接、去載體后得到該菌的ITS序列為638bp，GenBank登錄號(hào)為FJ528078。利用軟件Clustalx1.83對(duì)該菌ITS序列和GenBank中現(xiàn)有的部分序列進(jìn)行比對(duì)與聚類分析，并運(yùn)用Mega4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明該菌與報(bào)道的長梗木霉親緣關(guān)

7、系最為緊密，所以我們將該菌命名為Trichoderma longibrachiatum XST1。 為得到Trichoderma longibrachiatum XST1單一外切纖維素酶組分，研究其與其他酶組份共同降解纖維素的機(jī)理以及與其他纖維素酶組份以一定比例進(jìn)行復(fù)配來滿足其在不同工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，我們進(jìn)一步克隆了該菌的外切纖維素酶(CBH)基因及其cDNA，并實(shí)現(xiàn)了該外切纖維素酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)，主要研究?jī)?nèi)容及成果如下

8、： 1.外切纖維素酶基因的基因組DNA和cDNA的克隆及序列分析 參照NCBI基因庫中外切纖維素酶相關(guān)基因序列序列設(shè)計(jì)引物。采用CTAB法提取長梗木霉XST1菌株的基因組DNA，Trizol法提取該菌株的總RNA。分別以基因組和總RNA為模板，應(yīng)用PCR、RT-PCR方法擴(kuò)增cbh全長基因組序列和cDNA序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收后，連接到pMD18-T simple載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，應(yīng)用氨卞抗性平

9、板篩選陽性克隆子，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確后送交上海生工測(cè)序部測(cè)序，獲得了該菌的cbh全長基因組序列和cDNA序列。 cbh I測(cè)序結(jié)果表明：以基因組DINA為模板得到的cbh I全長序列為1681 bp，而以cDNA為模板得到的cbh I序列為1545bp。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：cbh I-DNA的426-527 bp和1226-1294 bp的位置為內(nèi)含子序列，將cbh I-DNA與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)Blast同源檢索，發(fā)現(xiàn)它與綠色

10、木霉(Trichoderma viride)cbh I序列同源性高達(dá)91％。cbh I-cDNA基因序列提交GenBank，其登錄號(hào)為FJ026620。cbh I基因編碼514個(gè)氨基酸，與其他同源的CBH I蛋白具有高度的序列相似性。其中第1-18個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，第19-448位氨基酸殘基為催化結(jié)構(gòu)域(CatalyticDomain，CD)，第482-514個(gè)氨基酸殘基為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cellulose BindingDo

11、main，CBD)，該酶的活性中心可能為Glu229、Asp231、Glu234位的三個(gè)氨基酸殘基。 cbh II測(cè)序結(jié)果表明：以基因組DNA為模板得到的cbh II全長1583 bp，而以cDNA為模板得到的cbh II為1413 bp。序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)：94-144 bp，529-584 bp和832-894 bp的位置為內(nèi)含子。將cbh II-DNA與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)Blast同源檢索，發(fā)現(xiàn)它與康氏木霉(Hypocr

12、ea koningii)cbh II序列同源性達(dá)100％。該基因序列已提交GenBank，登錄號(hào)為FJ026621。cbh II基因編碼470個(gè)氨基酸，與其他同源CBH II蛋白具有高度的序列相似性。CBH II的第1-24個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，第31-62個(gè)氨基酸殘基為CBD區(qū)域，第123-436位氨基酸殘基為CD區(qū)域，其活性位點(diǎn)可能為Asp198、Asp244、Asp424位的三個(gè)天冬氨酸殘基。 2.cbh-cDNA基因

13、表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)cbh I-cDNA基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將克隆在pMD18-T載體上的cbh I-cDNA基因片段，先用限制性內(nèi)切酶AVR II單酶切，回收酶切產(chǎn)物，再用Not I進(jìn)行第二次酶切，回收二次酶切產(chǎn)物。表達(dá)載體pPIC3.5K載體也用這兩個(gè)酶進(jìn)行分步酶切后進(jìn)行回收。用T4 DNA連接酶連接回收的基因片段和表達(dá)載體pPIC3.5K，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素平板篩選克隆子，再經(jīng)菌落PCR

14、、質(zhì)粒酶切及測(cè)序等方法驗(yàn)證插入片段的大小和閱讀框的正確性，將驗(yàn)證為正確的重組質(zhì)粒命名為pPIC3.5K-cbh I。 (2)cbh II-cDNA基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將克隆在pMD18-T載體上的cbh II-cDNA基因片段，用EcoR I和Not I雙酶切，回收基因片段。表達(dá)載體pPIC3.5K載體也用同樣的兩個(gè)酶雙酶切后回收。用T4 DNA連接酶連接回收的基因片段和表達(dá)載體pPIC3.5K，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受

15、態(tài)細(xì)胞，通過卡那霉素抗性平板篩選克隆子，再經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切及測(cè)序等方法驗(yàn)證插入片段的大小和閱讀框的正確性，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為。pPIC3.5K-cbh II。 3.cbh-cDNA基因的表達(dá) 通過電轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂布到MD平板上培養(yǎng)，待長出菌落后，利用PCR法篩選酵母重組菌株，并對(duì)篩選為陽性的酵母重組菌株在BMMY中用0.5％濃度的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，發(fā)酵上清液在CMC酶活驗(yàn)證

16、板中均出現(xiàn)了透明水解圈，分別以CMC和。pNPC為底物，測(cè)定發(fā)酵上清液中的外切纖維素酶的酶活，同時(shí)濃縮發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達(dá)情況。其中外切纖維素酶I的CMC酶活最高為26.40 U/mL，pNPC酶活最高為28.89U/L，兩者均出現(xiàn)在72小時(shí)；外切纖維素酶II的CMC酶活最高為24.70 U/mL，pNPC酶活最高為26.39 U/L，兩者均出現(xiàn)在96小時(shí)。SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)陰性對(duì)照泳道均無相應(yīng)條帶出現(xiàn)