綠色木霉中纖維素酶相關(guān)基因的克隆、定點突變及其真核表達.pdf

1、纖維素資源是地球上最豐富的可再生資源，有效利用纖維素資源，可以緩解世界范圍內(nèi)日益突出的糧食和能源短缺問題。纖維素酶通過纖維素酶中三種組分：內(nèi)切葡聚糖苷酶（endoglucanase，EG），外切葡聚糖苷酶（cellubiohydralases，CBH），以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases，BG）的協(xié)同作用將纖維素水解為葡萄糖。纖維素酶的酶活力影響著纖維素酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，運用基因克隆、基因表達、纖維素酶蛋白分子的改造和

2、設(shè)計等手段獲得人們所期望的高酶活的纖維素酶成為研究熱點。綠色木霉（Trichoderma viride）是產(chǎn)纖維素酶活性最高的菌株之一，它在自然界分布廣泛，常腐生于木材、種子及植物殘體上。白蟻（Coptotermes formoscmus）以朽木等富含纖維素的木質(zhì)性物質(zhì)為食，腸道微生物中富含纖維素降解菌。
　　 本論文從室外多年放置的朽木中分離得到可分解纖維素的真菌G-1，從白蟻腸道微生物中分離得到可分解纖維素的真菌G-2，經(jīng)過

3、菌落形態(tài)和菌絲形態(tài)觀察及18Sr DNA序列分析鑒定真菌G-1，G-2為綠色木霉（Trichoderma viride）。從G-1中克隆得到內(nèi)切葡聚糖苷酶基因（EGⅡ, Genbank:HM116999.1）和外切葡聚糖苷酶基因（CBHⅡ, Genbank:HM117000.1），從G-2中克隆得到兩個β-1，4-葡萄糖苷酶基因（BGⅠ, Genbank: HM178944.1；BGⅡ, Genbank: HM178945.1）。根據(jù)序

4、列比對分析，對克隆到的EGⅡ和CBHⅡ基因序列進行定點突變，得到兩條突變序列EGⅡ-mut和CBHⅡ-mut，使其編碼的氨基酸序列產(chǎn)生突變，意在增加其表達蛋白的酶活力。
　　 將EGⅡ, EGⅡ-mut, CBHⅡ去掉自身信號肽序列，構(gòu)建分泌型表達載體pPIC9K-EGⅡ，pPIC9K-EGⅡ-mut，pPIC9K-CBHⅡ，轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115進行誘導(dǎo)表達。經(jīng)MD, MM板篩選得到轉(zhuǎn)化

5、子，用剛果紅染色法進進行粗篩，再用DNS法對酶活性進行測定，篩選得到胞外分泌酶活力較高的重組畢赤酵母菌株GS115-EGⅡ-7，GS115-EGⅡ-mut-10，GS115-CBHⅡ-2。GS115-EGⅡ-7，GS115-EGⅡ-mut-10的內(nèi)切葡聚糖酶活力分別為20.915U/ml，24.110U/ml。GS115-CBHⅡ-2的外切葡聚糖酶活力達到27.925U/ml。突變序列（EGⅡ-mut）的重組畢赤酵母菌株比原序列（EGⅡ

6、）的重組畢赤酵母胞外分泌內(nèi)切葡聚糖酶的酶活力提高了，結(jié)果表明某些定點突變可以揭示影響酶活的重要功能域，為使用分子生物學(xué)的方法改造纖維素酶基因以獲得高酶活的纖維素酶奠定基礎(chǔ)。
　　 本論文構(gòu)建了6個釀酒酵母表達載體，pYES2/CT/lacZ-EGⅡ, pYES2/CT/lacZ-EGⅡ-mut, pYES2/CT/lacZ-BGⅠ, pYES2/CT/lacZ–BGⅡ, pYES2/CT-CBHⅡ, pYES2/CT-CBHⅡ-