康氏木霉纖維素酶基因（EGⅠ）的克隆與表達(dá).pdf

1、纖維素酶是天然纖維生物降解最主要的酶類?？凳夏久故且环N常見產(chǎn)纖維素酶的微生物，但真菌的發(fā)酵周期較長，酶的產(chǎn)量和特性不易控制。因此，構(gòu)建和利用基因工程菌作為大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶的一種途徑。本論文利用大腸桿菌作為宿主菌克隆表達(dá)了康氏木霉纖維素酶基因(EGI)。 康氏木霉需要誘導(dǎo)才能產(chǎn)纖維素酶，而碳源是主要的誘導(dǎo)物。在擴(kuò)增基因之前選擇廉價(jià)的碳源(山梨糖，微晶纖維素、稻草細(xì)粉等)誘導(dǎo)培養(yǎng)康氏木霉，定時(shí)取樣，測定內(nèi)切葡聚糖酶酶活(CMC酶

2、活)、外切葡聚糖酶酶活(P-NPC酶活)以及總酶活(濾紙酶活；FPA酶活)，探討不同碳源對康氏木霉產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)作用，為下一步分子克隆奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以微晶纖維素為碳源誘導(dǎo)康氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶活最高，第三天內(nèi)切CMC酶活即達(dá)到17.58U/mL，外切P-NPC酶活達(dá)到11.39 U/mL，濾紙酶活達(dá)到1.68 U/mL。 以微晶纖維素為碳源誘導(dǎo)培養(yǎng)康氏木霉，提取總RNA，并以其為模板，利用RT-PCR擴(kuò)增纖維素酶的c

3、DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析及測序驗(yàn)證后重組到T7啟動子控制下的表達(dá)載體pET·His中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)plysS中，經(jīng)IPTG(0.4mmol/L)誘導(dǎo)3h后，破胞提取菌體總蛋白，SDS-PAGE表明重組產(chǎn)物為一分子量約為45kDa的蛋白質(zhì)，是與預(yù)期目的蛋白相一致的外源蛋白。 對重組酶的粗酶液進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，表明：重組酶在pH5.0～7.0之間保持相對較穩(wěn)定，以pH值為6.0時(shí)