FOXA2通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)抑制肝癌轉(zhuǎn)移.pdf

1、[研究背景及目的]
　　迄今為止，肝細(xì)胞癌(HCC)仍然是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率和死亡率均位居所有惡性腫瘤前列。由于存在大量乙肝病毒感染者，我國是肝癌高發(fā)區(qū)，每年約有11萬人死于該病。目前，肝癌的治療強(qiáng)調(diào)手術(shù)、介入治療、化療、生物治療等綜合治療。而手術(shù)治療仍然是肝癌綜合治療中最重要的一環(huán)，其對改善肝癌患者預(yù)后至關(guān)重要，但是肝癌的局部及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響手術(shù)患者預(yù)后，大大降低了肝癌患者的生存時間。而對于肝癌的轉(zhuǎn)移，目前尚

2、缺乏有效藥物進(jìn)行預(yù)防和治療，因此目前肝癌的五年生存率依然很低。
　　肝癌轉(zhuǎn)移是一個涉及多基因參與的復(fù)雜過程。目前研究認(rèn)為，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生中的重要事件，在肝癌轉(zhuǎn)移中起著重要的促進(jìn)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)多種信號通路參與EMT過程，比如PI3-K/Akt，Wnt，Notch，Hedgehogand nuclear factor-kappaB等，但肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全完全闡明。
　　肝細(xì)胞核因子(HNFs)

3、家族對肝臟的分化、發(fā)育以及成熟肝細(xì)胞正常功能的維持起著決定性的作用。前期研究表明，HNF4α和HNF1α均可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞向正常肝細(xì)胞分化，并顯著抑制肝臟種植瘤的生長。晚近，Hatziapostolou M等發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中一過性的下調(diào)HNF4α可以通過激發(fā)miRNA調(diào)節(jié)環(huán)路誘發(fā)肝細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程。小鼠成熟肝細(xì)胞中敲除HNF4α可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生。這些研究結(jié)果都說明HNFs作為肝臟分化調(diào)控因子在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中同樣起著核心作用。

4、　　轉(zhuǎn)錄因子FOXA（又被稱為HNF3）包括FOXA1(HNF3α)，F(xiàn)OXA2(HNF3β)和FOXA3(HNF3γ)，因其含有翼螺旋/叉頭DNA結(jié)合區(qū)而得名。既往研究表明FOXA2在肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)。晚近研究發(fā)現(xiàn)，IKK-α介導(dǎo)的FOXA2磷酸化失活對肝臟炎-癌演變起至關(guān)重要的作用，且Foxa1和Foxa2對于肝癌發(fā)生的性別差異也起著決定性作用。但FOXA2在肝癌轉(zhuǎn)移過程中的作用尚無報道。
　

5、　基于FOXA2在肝細(xì)胞分化、肝臟發(fā)育中的重要地位以及在HCC發(fā)生中的重要作用，在本研究中我們檢測肝癌組織、癌旁組織中FOXA2的表達(dá)差異，比較不同肝腫瘤細(xì)胞株中FOXA2表達(dá)量及其與細(xì)胞遷移能力的關(guān)系，利用慢病毒體外感染肝腫瘤細(xì)胞株，通過上調(diào)FOXA2及下調(diào)FOXA2表達(dá)檢測其對肝腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞遷移、侵襲以及在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。并進(jìn)一步闡述FOXA2抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療肝癌轉(zhuǎn)移提供新的靶點(diǎn)和工具。

6、　　[實(shí)驗(yàn)方法]
　　一、檢測FOXA2在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中變化情況
　　1.利用Real-time RT-PCR及Western blot方法檢測72例人肝癌組織(標(biāo)記為“N”)、癌旁組織（標(biāo)記為“T”）和肝臟門靜脈癌栓組織（標(biāo)記為“P”）中FOXA2表達(dá)量差異。
　　2.根據(jù)有無血運(yùn)轉(zhuǎn)移將72對人肝癌組織標(biāo)本按進(jìn)行分組（有轉(zhuǎn)移組命名為HCC-Ⅵ組，相反則為HCC組），比較兩組間FOXA2表達(dá)量差異。
　

7、　3.分析肝癌患者肝癌組織中FOXA2表達(dá)量與血管侵犯、包膜完整度、腫瘤分化程度、TNM分期、單反/多發(fā)病灶間等病理特征的關(guān)系。
　　二、制備過表達(dá)FOXA2及其低表達(dá)慢病毒載體
　　1.FOXA2過表達(dá)載體
　　表達(dá)FOXA2慢病毒載體pSin-EF1α-FOXA2及對照病毒pSin-EF1α-GFP在前期實(shí)驗(yàn)中已由本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建。
　　2.FOXA2低表達(dá)載體
　　小干擾FOXA2慢病毒載體系統(tǒng)由骨架

8、質(zhì)粒pLKO.1及包裝質(zhì)粒pMD2.G及psPAX2三質(zhì)粒組成，均購自Addgene。人工合成含有shFOXA2轉(zhuǎn)錄模板以及互補(bǔ)序列的單鏈DNA片段，重組后獲得質(zhì)粒pLKO.1-shFOXA2。將pLKO.1-shFOXA2骨架質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得慢病毒lenti-shFOXA2。以相同方法獲得對照病毒lenti-shNC。
　　三、檢測FOXA2對肝癌細(xì)胞株EMT的影響
　　1.

9、利用Real-time RT-PCR及Western blot方法檢測不同肝癌細(xì)胞株中FOXA2表達(dá)量與EMT標(biāo)志基因E-caherin及Vimentin表達(dá)量的關(guān)系。
　　2.利用過表達(dá)慢病毒pSin-EF1α-FOXA2感染肝癌細(xì)胞株Focus，上調(diào)其中FOXA2表達(dá)，檢測肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及E-cadherin、Vimentin表達(dá)量變化情況;利用小干擾慢病毒pLKO.1-shFOXA2感染肝癌細(xì)胞株HepG2，下調(diào)細(xì)胞株中

10、FOXA2表達(dá)，同樣方法觀察細(xì)胞形態(tài)變化及E-cadherin、Vimentin表達(dá)量變化情況。
　　四、觀察FOXA2變化對肝癌細(xì)胞株遷移及侵襲能力的影響
　　1.利用Real-time PCR、Western blot、Transwell方法檢測不同肝癌細(xì)胞株中FOXA2表達(dá)量及其與細(xì)胞遷移能力的關(guān)系。
　　2.分別利用過表達(dá)、低表達(dá)慢病毒載體，觀察FOXA2表達(dá)變化對肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的作用。
　　五、

11、觀察FOXA2對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響
　　1.構(gòu)建表達(dá)熒光素酶(Luciferase，Luc)慢病毒骨架質(zhì)粒pSin-EF1α-Luc，并使用相同方法包裝得到慢病毒lenti-Luc，該病毒具有嘌呤霉素抗性。
　　2.利用lenti-Luc感染Focus細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選、挑單克隆培養(yǎng)及熒光素酶表達(dá)驗(yàn)證建立高效表達(dá)Luc穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Focus-Luc。
　　3.將lenti-FOXA2或lenti-GFP感染的Foc

12、us-Luc細(xì)胞以2×105/只種植于免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)腋窩皮下，每周使用游標(biāo)卡尺測量皮下成瘤大小，同時使用活體成像觀察遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移情況。
　　4.Focus-Luc細(xì)胞株分別感染慢病毒lenti-FOXA2或?qū)φ詹《緇enti-GFP后，以2×105/只經(jīng)尾靜脈注入免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)體內(nèi)，利用活體成像技術(shù)觀察其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況。
　　六、探討FOXA2抑制肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制
　　1.利用R

13、eal-time PCR及Western blot方法檢測在肝癌細(xì)胞中上調(diào)FOXA2及下調(diào)FOXA2表達(dá)對MMP9表達(dá)的影響。
　　2.利用JASPAR[1]數(shù)據(jù)庫預(yù)測FOXA2在MMP9啟動子附近潛在的結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建包含不同結(jié)合位點(diǎn)的報告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入過表達(dá)lenti-FOXA2或lenti-GFP的Focus細(xì)胞株，通過檢測熒光素酶表達(dá)水平預(yù)測FOXA2在MMP9基因上的結(jié)合位點(diǎn)，并使用ChIP方法明確該結(jié)合位點(diǎn)。

14、>　　3.肝癌細(xì)胞株HepG2分別轉(zhuǎn)染NC、FOXA2 siRNA、MMP9 siRNA、FOXA2siRNA+MMP9 siRNA，檢測上述不同處理對細(xì)胞遷移能力的影響;利用Real-timeRT-PCR、Western blot方法檢測小鼠體皮下成瘤組織及人肝癌組織中FOXA2、MMP9表達(dá)量，并分析兩者的關(guān)系。
　　七、統(tǒng)計學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以Mean±SD表示。兩組間采用t檢

15、驗(yàn)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間采用One-Way ANOVA分析，計數(shù)資料使用x2檢驗(yàn)，非成對t檢驗(yàn)，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn);P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有非常顯著性。
　　[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　一、FOXA2表達(dá)量與肝癌發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示，在72例肝癌標(biāo)本中，68.1％(49/72)的肝癌組織較癌旁組織FOXA2表達(dá)量明顯下降;HCC-Ⅵ組肝癌組織中

16、FOXA2表達(dá)量較HCC組明顯下降。
　　2.對4例伴有門脈癌栓的肝癌標(biāo)本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示門靜脈癌栓組織中FOXA2表達(dá)量較肝癌組織進(jìn)一步下降。
　　3.對72例肝癌患者的臨床資料與FOXA2表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果表明人肝癌組織中FOXA2表達(dá)量與血管侵犯、分化程度、TNM分期均呈負(fù)相關(guān)，而與患者年齡、性別、腫瘤大小、AFP、HBsAg、癌結(jié)節(jié)數(shù)量、包膜侵犯均無顯著相關(guān)性。
　　二、成功構(gòu)建小干擾FOXA2慢病毒le

17、nti-shFOXA2及對照病毒lenti-shNC
　　空載慢病毒骨架質(zhì)粒pLKO.1經(jīng)EcoRⅠ及AgeⅠ酶切后分別與含有編碼shFOXA2及shNC的雙鏈DNA片段連接得到小干擾慢病毒骨架質(zhì)粒pLKO.1-shFOXA2及對照病毒骨架質(zhì)粒pLKO.1-shNC，兩者分別與包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，收取含有病毒顆粒的培養(yǎng)液上清，離心、過濾后分別得到小干擾FOXA2慢病毒lenti-FOXA2及對

18、照病毒lenti-shNC。
　　三、FOXA2抑制肝癌細(xì)胞EMT
　　1.在肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、MHCC97L、MHCC97H、MHCCLM3、Focus中，F(xiàn)OXA2表達(dá)量與上皮細(xì)胞標(biāo)志基因E-caherin表達(dá)量呈正相關(guān)，與間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因Vimentin表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。
　　2.在Focus細(xì)胞中過表達(dá)FOXA2后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞梭形觸角消失，由長條狀變?yōu)闇唸A狀，E-cadherin表達(dá)

19、明顯上升，Vimentin表達(dá)下降;在HepG2細(xì)胞中小干擾FOXA2后，細(xì)胞形態(tài)由渾圓變得細(xì)長，出現(xiàn)梭形觸角，E-cadherin表達(dá)下降，Vimentin表達(dá)量明顯上升。
　　四、FOXA2顯著影響肝癌細(xì)胞的遷移及侵襲
　　1.FOXA2表達(dá)量與肝癌細(xì)胞株Huh7、HepG2、MHCC97L、MHCC97H、MHCCLM3、Focus的遷移能力成負(fù)相關(guān)。
　　2.利用慢病毒載體上調(diào)及下調(diào)FOXA2表達(dá)后，Trans

20、well方法檢測結(jié)果顯示FOXA2顯著抑制肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。
　　五、FOXA2抑制肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移
　　1.為獲得表達(dá)熒光素酶基因的穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株，構(gòu)建表達(dá)Luciferase的慢病毒骨架質(zhì)粒pSin-EF1α-Luc，并與pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，得到慢病毒lenti-Luc。經(jīng)感染慢病毒lenti-Luc、嘌呤霉素篩選、挑單克隆、熒光素酶表達(dá)驗(yàn)證成功得到穩(wěn)定、高效表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞株F

21、ocus-Luc。
　　2.在皮下種植瘤肝癌轉(zhuǎn)移模型中，過表達(dá)FOXA2的肝癌細(xì)胞在皮下成瘤的體積、重量沒有統(tǒng)計學(xué)差異(2.36±2.40 cm3 vs.3.90±2.52 cm3，P=0.403)，但其在小鼠骨組織、腦組織中形成的轉(zhuǎn)移灶明顯減少，GFP組的骨轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移分別為100％(5/5)、20％(1/5)，而FOXA2處理組相應(yīng)的轉(zhuǎn)移率為20％(1/5)、0％(0/5)。
　　4.尾靜脈注射肝癌轉(zhuǎn)移模型結(jié)果顯示，F(xiàn)O

22、XA2顯著抑制肝癌細(xì)胞株的肺轉(zhuǎn)移:GFP組的肺轉(zhuǎn)移率為60％(3/5)，F(xiàn)OXA2處理組沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移(0/5)。
　　六、FOXA2部分通過轉(zhuǎn)錄水平抑制MMP9表達(dá)抑制肝癌轉(zhuǎn)移
　　1.在Focus細(xì)胞中過表達(dá)FOXA2后，MMP9表達(dá)量明顯下降;在HepG2細(xì)胞中小干擾FOXA2后，MMP9表達(dá)量明顯上升。
　　2.使用JASPAR數(shù)據(jù)庫對MMP9基因啟動子-1000bp至3000bp區(qū)域進(jìn)行分析，預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子F

23、OXA2潛在結(jié)合位點(diǎn)6個，使用報告基因pGL3-promoter進(jìn)行定位分析得出:FOXA2可結(jié)合于啟動子下游511-988bp區(qū)域，而此區(qū)域位于MMP9基因第一個內(nèi)含子上;進(jìn)一步的ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)FOXA2可直接結(jié)合于此區(qū)域。
　　3.干擾FOXA2表達(dá)后可使HepG2細(xì)胞的遷移能力升高，而同時干擾MMP9表達(dá)可減弱此作用;與對照組相比，過表達(dá)FOXA2后的Focus細(xì)胞成瘤組織中，MMP9表達(dá)量明顯下降;在72例人肝癌組