中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動結(jié)合改性羥基磷灰石-殼聚糖復(fù)合水凝膠對大鼠髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的影響.pdf

1、在關(guān)節(jié)內(nèi)骨的末端覆蓋著一種獨(dú)特的結(jié)締組織——關(guān)節(jié)軟骨，其功能為緩沖關(guān)節(jié)的靜態(tài)和動態(tài)負(fù)荷、減輕關(guān)節(jié)運(yùn)動時的摩擦并順利完成關(guān)節(jié)的活動。健康的軟骨是肢體活動的必需條件，各種關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、骨關(guān)節(jié)病和骨關(guān)節(jié)腫瘤都會破壞關(guān)節(jié)軟骨。軟骨主要由軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外網(wǎng)狀膠原纖維、糖胺多糖和水組成，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，其內(nèi)無血管及神經(jīng)，其獲得營養(yǎng)的方式也不同于其他組織。幼年時關(guān)節(jié)軟骨主要靠軟骨下骨輸送營養(yǎng)，成年后主要靠與關(guān)節(jié)液進(jìn)行物質(zhì)交換來獲得營養(yǎng)。由于與關(guān)節(jié)液進(jìn)

2、行物質(zhì)交換需要軟骨自身結(jié)構(gòu)的完整，成年后又無軟骨下骨的營養(yǎng)支持，所以關(guān)節(jié)軟骨一旦受損很難恢復(fù)，最終往往導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎，致使關(guān)節(jié)功能喪失。因此一直以來，關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)都是臨床上棘手的熱點(diǎn)問題。
　　當(dāng)下尚未有一種治療軟骨損傷的金標(biāo)準(zhǔn)方法，其治療方法仍然存在較多爭議。目前有藥物療法，生物療法，外科手術(shù)治療，生物工程材料植入治療等。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物是比較傳統(tǒng)的治療方法，如注射透明質(zhì)酸，但藥物僅能使關(guān)節(jié)面的摩擦應(yīng)力減少，延緩關(guān)節(jié)退變，其對

3、軟骨的再生并無顯著作用，因此只能起到緩解作用，無法去除病因。生物療法是近十幾年的新興療法，越來越受到重視，各種生物制劑的研發(fā)如火如荼，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)、富血小板因子血漿(PRP)等，大部分的動物研究表明其有效性，但臨床應(yīng)用尚未成熟，需要進(jìn)一步明確長期療效。外科手術(shù)治療在臨床上應(yīng)用廣泛，如微骨折術(shù)、鉆孔術(shù)、自體或異體骨軟骨移植，自體軟骨細(xì)胞移植(ACI)，雖然方法眾多，但都有各自的局限性及缺點(diǎn)，且運(yùn)用手術(shù)治療所修復(fù)和重建的軟

4、骨與正常的關(guān)節(jié)軟骨組織存在一定差異，而且手術(shù)中的微骨折的處理和自身軟骨的移植也會造成損傷。生物組織工程材料近年來取得了巨大的進(jìn)展，多種組織工程化的凝膠及支架被證實(shí)在軟骨缺損的修復(fù)過程中起到促進(jìn)作用。其作用原理是在軟骨缺損部位形成了結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度類似于軟骨基質(zhì)的生物材料填充，既能在早期添補(bǔ)缺損部位，使關(guān)節(jié)面保持原有的形態(tài)，又能為間充質(zhì)細(xì)胞提供良好的增殖和分化環(huán)境，在修復(fù)過程中使再生軟骨更加接近正常軟骨的形態(tài)及組織學(xué)特點(diǎn)。殼聚糖是一種天然高分子

5、材料，具有天然的抗菌性能、生物可降解性能，以及良好的組織相容性，因此被廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。殼聚糖在結(jié)構(gòu)上與糖胺多糖(GAG)和關(guān)節(jié)軟骨中的透明質(zhì)酸具有相似性，其能為軟骨細(xì)胞提供更加類似于軟骨基質(zhì)的環(huán)境，使重建的軟骨組織接近正常軟骨的形態(tài)，所以此類殼聚糖水凝膠被廣泛的應(yīng)用到軟骨修復(fù)，這一點(diǎn)也在多篇文獻(xiàn)中被證實(shí)。本實(shí)驗所使用的材料為改性羥基磷灰石殼聚糖(CS/HA-g-CS)復(fù)合水凝膠，這種改性水凝膠的制備采用了物理交聯(lián)方法，

6、使羥基磷灰石納米粒子與殼聚糖的相容性得到了提高，并能提高凝膠的抗壓強(qiáng)度和延長了其降解的時間。
　　軟骨缺損后缺乏營養(yǎng)支持是軟骨缺損難以修復(fù)的重要原因。大量文獻(xiàn)報道制動會導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化，其原因在于成年后軟骨無軟骨下骨的營養(yǎng)支持需要靠與關(guān)節(jié)液物質(zhì)交換來獲取營養(yǎng)，關(guān)節(jié)活動所產(chǎn)生的關(guān)節(jié)內(nèi)壓力能促進(jìn)關(guān)節(jié)液的流動，有利于軟骨與關(guān)節(jié)液之間的物質(zhì)交換，而制動會阻止這種作用。也有文獻(xiàn)報道過強(qiáng)的關(guān)節(jié)活動都會導(dǎo)致軟骨退變，目前普遍認(rèn)為合適的應(yīng)力刺激與

7、正常軟骨的生理活動密切相關(guān)，適度的運(yùn)動能提高關(guān)節(jié)軟骨的質(zhì)量。關(guān)節(jié)運(yùn)動過程中對關(guān)節(jié)軟骨施加壓力到無壓力的周期變化使軟骨如同周期性吸水和擠水的海綿，形成了所謂的“軟骨泵”，這就是軟骨獲取營養(yǎng)的機(jī)制。軟骨缺損后運(yùn)動康復(fù)的理論基礎(chǔ)便是軟骨的營養(yǎng)機(jī)制，而且適度的運(yùn)動還能減少損傷后關(guān)節(jié)內(nèi)外的粘連，增加周圍肌肉的肌力及肌腱和關(guān)節(jié)囊的穩(wěn)定性。已有學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動能提高軟骨中糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型膠原(College-Ⅱ)的含量并能促進(jìn)非

8、負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，高強(qiáng)度會破壞軟骨而低強(qiáng)度作用并不顯著。通過查閱大量文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)對跑臺運(yùn)動的研究大多是在正常軟骨和未修復(fù)的軟骨缺損上進(jìn)行的，而跑臺運(yùn)動對于已進(jìn)行修復(fù)的軟骨缺損的作用未見報道。軟骨缺損修復(fù)的機(jī)理為:缺損區(qū)軟骨下骨的出血使缺損部位形成血腫，同時有多分化傾向的間充質(zhì)細(xì)胞由基底部松質(zhì)骨進(jìn)入缺損區(qū)內(nèi)并增殖，缺損區(qū)內(nèi)形成了由紅細(xì)胞、白細(xì)胞和未分化細(xì)胞組成的纖維素凝塊，凝塊進(jìn)一步機(jī)化形成肉芽組織，肉芽組織化生形成成纖維軟骨，

9、而后再次機(jī)化為類透明軟骨。我們假設(shè)在對大鼠軟骨缺損進(jìn)行組織工程修復(fù)治療后進(jìn)行了中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動康復(fù)鍛煉，運(yùn)動康復(fù)可能在軟骨修復(fù)過程中干擾到間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化，而在缺損處植入CS/HA-g-CS水凝膠可以在早期為缺損修復(fù)提供穩(wěn)定的環(huán)境，減少應(yīng)力對未分化間充質(zhì)干細(xì)胞的影響，并在缺損處形成了類似軟骨基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，有利于間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化。這樣既能獲得軟骨泵的營養(yǎng)支持作用，防止關(guān)節(jié)內(nèi)的黏連，又能避免跑臺運(yùn)動可能對修復(fù)組織產(chǎn)生的干擾，

10、那么中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動結(jié)合CS/HA-g-CS水凝膠對大鼠髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的效果是會優(yōu)于單獨(dú)進(jìn)行跑臺運(yùn)動或單獨(dú)使用CS/HA-g-CS水凝膠的效果的。為了證實(shí)我們的假設(shè)，我們進(jìn)行了本實(shí)驗的研究。
　　目的:
　　研究中等強(qiáng)度跑臺結(jié)合改性羥基磷灰石殼聚糖(CS/HA-g-CS)復(fù)合水凝膠對大鼠髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的效果。
　　方法:
　　將24只250-300g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:空白對照組(BC組)、水

11、凝膠植入組（CHI組）、跑臺運(yùn)動組（MIR組）、水凝膠結(jié)合跑臺運(yùn)動組（CHI+MIR組），建立直徑1mm、深度1mm觸及軟骨下骨的圓柱形雙側(cè)髕股關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，CHI組和CHI+MIR組在缺損處植入改性羥基磷灰石殼聚糖復(fù)合水凝膠，其中MIR組和CHI+MIR組在造模后4周開始中等強(qiáng)度跑臺運(yùn)動（跑臺坡度5°，20m/min×40min/d×5d/w），其余兩組置于籠中自由喂養(yǎng)。分別在跑臺運(yùn)動后4周和12周切開關(guān)節(jié)行大體觀察評分，取造模膝

12、關(guān)節(jié)石蠟包埋切片并予以番紅O-固綠染色行組織學(xué)觀察，取缺損處修復(fù)組織行PCR檢測其糖胺多糖(GAG)、Ⅱ型膠原(College-Ⅱ)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　大體評分:4周時CHI+MIR組顯著優(yōu)于其余3組，BC組明顯低于其余3組，MIR組和CHI組比較無統(tǒng)計學(xué)意義;12周時BC組低于其余3組，其余各組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義。O'Driscoll組織學(xué)評分:4周時，CHI+MIR組顯著高于其余三

13、組(P＜0.05)，BC組顯著低于其余三組(P＜0.05)，MIR組和CHI組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.087);12周時，CHI+MIR組顯著高于其余三組(P＜0.05)，BC組顯著低于其余三組(P＜0.05)，MIR組和CHI組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.787)。Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá):4周時，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，CHI+MIR組顯著高于其他3組，MIR組顯著高于BC組，BC組表達(dá)最低，CHI組與MIR組比

14、較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.063);12周時，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.007)，BC組和CHI組顯著低于MIR組和CHI+MIR組，其余各組間濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(BC vs CHI P=0.369;MIR vs MIR+CHIP=0.463)。糖胺多糖mRNA的表達(dá):4周時，各組糖胺多糖均有表達(dá)，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.047)，BC組顯著低于CHI組和CHI+MIR組，其余各組間濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(BC vs

15、 MIRP=0.298;CHI vs MIRP=0.172;CHIvs CHI+MIRP=0.588;MIR vs CHI+MIRP=0.073);12周時，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，CHI+MIR組顯著高于其他3組，BC組顯著低于其余三組，BC組表達(dá)最低，CHI組與MIR組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.063)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白mRNA的表達(dá):4周時，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，CHI+MIR組明顯高于

16、其他三組，其余各組間無統(tǒng)計學(xué)意義(BC vsCHI P=0.431;BC vs MIRP=0.257;CHI vs MIRP=0.707);12周時，各組間濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)，BC組和CHI組顯著低于MIR組和MIR+CHI組，其余各組無統(tǒng)計學(xué)意義(BC vs CHIP=0.557;MIR vs MIR+CHIP=0.329)。
　　結(jié)論:
　　中等強(qiáng)度跑臺結(jié)合改性羥基磷灰石殼聚糖復(fù)合水凝膠對大鼠髕股關(guān)節(jié)