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文檔簡介
1、本文研究根據(jù)前期研究達到的結(jié)果,試圖從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上分離和鑒定與Profilin 2特異結(jié)合的蛋白質(zhì),為說明Profilin 2在細胞中的特異分布提供科學(xué)依據(jù)。 為了從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離蛋白,選用擬南芥懸浮細胞為實驗材料。利用密度梯度離心方法分離出純化的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),經(jīng)過對傳統(tǒng)實驗方法的改進,將原來200分鐘的離心時間縮短到了70分鐘,從而保證了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的膜蛋白具有更好的生物活性,并且通過改變蔗糖密度梯度離心時各層蔗糖溶液的體積比例,使粗面內(nèi)
2、質(zhì)網(wǎng)的產(chǎn)率有了明顯的增加。通過電鏡觀察,證明獲得了較高純度的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。利用純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜與原核表達、純化的Profilin 2包被的膠體金顆粒的結(jié)合實驗,證明了Pofilin2是與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上膜蛋白的相互作用而結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的。為了分離與Pofilin2特異結(jié)合的膜蛋白,利用原核表達、純化的Profilin 1和Profilin2結(jié)合在Ni-NTA的瓊脂糖上,再結(jié)合Pull-down技術(shù),將分離出的蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE電泳,用改
3、進的銀染方法進行電泳結(jié)果顯色,顯示出有4條比較明顯地與Profilin 2特異結(jié)合的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白。選擇了其中一條含量最高的特異結(jié)合Profilin 2的蛋白條帶(28 kDa未知蛋白)進行切膠回收,使用LC-MS/MS液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)的特性分析。根據(jù)質(zhì)譜儀檢測到的所有肽段與擬南芥中已知蛋白質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進行匹對,結(jié)果顯示,質(zhì)譜儀檢測到的分值最高的肽段:擬南芥Profilin 1的N末端第56個氨基酸到第75個氨基酸中的
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