Cohn組分Ⅳ中結(jié)合珠蛋白的純化與鑒定.pdf

1、結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，Hp），又稱觸珠蛋白，是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，主要由肝臟合成。它最主要的功能是與游離的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結(jié)合并促進其從循環(huán)系統(tǒng)清除，從而避免對腎臟的損傷。
　　早在20世紀50年代，人們就開始了以血漿為原料分離純化結(jié)合珠蛋白的研究。然而，純化效率低、成本高影響結(jié)合珠蛋白的規(guī)?；苽洹?985年，結(jié)合珠蛋白濃縮制劑在日本上市，用于急性溶血狀態(tài)下一般性治療或者預防

2、性使用，包括燒傷、燙傷、輸血、體外循環(huán)心臟直視術等引起的溶血反應伴血紅蛋白血癥或血紅蛋白尿，以及手術干預前的預防性使用等。但是，到目前為止，歐洲、美國和中國尚無結(jié)合珠蛋白產(chǎn)品批準用于臨床。
　　本研究以血漿蛋白生產(chǎn)過程中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料，探索適于規(guī)?；苽浣Y(jié)合珠蛋白的工藝。研究內(nèi)容主要包括以下五部分：
　　首先，采用SDS-PAGE、免疫印跡及質(zhì)譜分析的方法證明了結(jié)合珠蛋白的確存在于Cohn組分Ⅳ中，明確了其

3、多聚體在非還原性SDS-PAGE中的位置主要位于245kD附近，為后續(xù)分離純化結(jié)合珠蛋白工藝的探索奠定基礎。
　　其次，本文重點從前處理和層析精制兩方面探索分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝。
　　前處理工藝中，根據(jù)Cohn組分Ⅳ中目的蛋白及主要雜蛋白（白蛋白、α1抗胰蛋白酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白等）的分子結(jié)構(gòu)及特性，分別采用PEG沉淀法、硫酸銨沉淀法、利凡諾-鹽析組合法三種方法進行前處理，通過對比分析具體數(shù)據(jù)，結(jié)果表明利凡諾-鹽析組合法是較為可

4、取的方法，該方法能夠有效去除雜蛋白，以白蛋白等小分子雜蛋白去除效果明顯，并使目的蛋白富集，使后續(xù)層析效果達到最佳，是一種簡單、有效的前處理方法，適用于規(guī)?；那疤幚磉^程。
　　層析分離工藝中，本研究探索三種不同的介質(zhì)（DEAE-Sephrose Fast Flow、QMA Spherosil M、Q-Sepharose Fast Flow）分別在不同pH條件下分離純化結(jié)合珠蛋白的效果。綜合比較發(fā)現(xiàn)，采用 Q-Sepharose F

5、ast Flow層析的分離方法，SDS-PAGE顯示其純度較好，且目的蛋白損失相對較少。
　　此外，采用利凡諾-鹽析的前處理方法對結(jié)合珠蛋白進行粗純，利用Q-Sepharose Fast Flow層析在pH5.5條件下實現(xiàn)對目的蛋白的分離，對工藝整體進行適當放大，結(jié)果表明工藝整體較為穩(wěn)定。
　　最后，利用Native-PAGE方法測的采用該工藝小試和適當放大后分離得到的目的蛋白的血紅蛋白結(jié)合活性分別為2.8U/mL（10mg

6、/mL）、3.75U/mL（15mg/mL）。采用免疫印跡及質(zhì)譜分析進一步證明該方法成功分離得到目的蛋白。
　　本研究以血液制品生產(chǎn)中的廢棄物Cohn組分Ⅳ為起始原料，探索分離純化結(jié)合珠蛋白的前處理及層析精制工藝，初步建立了利凡諾絡合-鹽析-Q-Sepharose Fast Flow離子交換層析分離純化結(jié)合珠蛋白的工藝，該工藝簡單，易于放大生產(chǎn)，具有較好應用前景。本研究為人結(jié)合珠蛋白的分離純化提供可參考借鑒的數(shù)據(jù)，為建立更加簡便經(jīng)