Nox-NADPH氧化酶誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在激素性股骨頭壞死中作用機(jī)制的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　本項(xiàng)目擬通過臨床、和動物實(shí)驗(yàn)兩方面的研究：
　　1）分析臨床不同類型股骨頭壞死患者氧化應(yīng)激和凋亡的關(guān)系；篩查Nox/NADPH氧化酶在股骨頭壞死中的表達(dá)；分析Nox/NADPH氧化酶在股骨頭壞死凋亡中可能的作用機(jī)制。
　　2）建立大鼠激素性股骨頭壞死模型，ROS抑制劑NAC和NADPH抑制劑DPI進(jìn)行激素性股骨頭壞死的治療。驗(yàn)證Nox-ROS-ASK1-p38/JNK通路在激素性股骨頭壞死中作用機(jī)制。

2、>　　方法：
　　1．收集臨床標(biāo)本，其中病理組激素性股骨頭壞死患者8例，創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者8例，對照組股骨頸骨折患者8例。HE染色和TUNEL染色評估股骨頭壞死病理情況和細(xì)胞凋亡水平；8-OHdG和4-HNE免疫組織化學(xué)染色評估組織氧化應(yīng)激狀態(tài)；RT-PCR和Western blot檢測篩查Nox/NADPH氧化酶在SIFHN中的表達(dá)；驗(yàn)證ASK1-p38/JNK信號通路在SIFHN中的作用。分析氧化應(yīng)激在激素性股骨頭壞死和創(chuàng)傷

3、性股骨頭壞死作用機(jī)制的不同。
　　2．健康成年雄性Wistar大鼠共60只，隨機(jī)分成六組（每組10只）。A：空白對照組(Control)；B：激素性股骨頭壞死組（Steroid）；C：單純 NAC組(NAC)；D：激素性股骨頭壞死+NAC治療組(NAC+Steroid)；E：單純 DPI組(DPI)；F：激素性股骨頭壞死+DPI治療組(DPI+Steroid)；所有分組大鼠均按20μg/kg經(jīng)腹腔注射大腸桿菌內(nèi)毒素2次，每次間隔2

4、4h；最后一次注射大腸桿菌內(nèi)毒素24h后，B組、D組和F組大鼠按40mg/kg劑量經(jīng)左側(cè)臀肌注射甲基強(qiáng)的松，注射連續(xù)3次，每次間隔24h，連續(xù)3天；A組、C組和E組注射同等劑量的生理鹽水，連續(xù)三天；之后C組和D組，大鼠按150mg/kg/d腹腔注射NAC，直到6周；E組和F組大鼠按1mg/kg/d右側(cè)臀部皮下注射DPI，直到6周。6周末，處死動物，一側(cè)股骨頭行顯微CT檢查后行HE染色和8-OHdG和4-HNE的免疫組織化學(xué)染色；另一側(cè)股

5、骨頭冠狀位切開兩半之后，用于RT-PCR和Western blot檢查，篩查Nox1、Nox2、Nox4、ASK1、p38和JNK的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．臨床標(biāo)本收集后，HE染色發(fā)現(xiàn)激素性股骨頭壞死和創(chuàng)傷性股骨頭壞死有明顯區(qū)別。SIFHN主要病理特點(diǎn)是
　　1）脂肪樣變明顯，髓腔內(nèi)大量的脂肪細(xì)胞；
　　2）出現(xiàn)軟骨下骨的微骨折，囊性變較多；
　　3）新生骨較少。這些病理特點(diǎn)都是創(chuàng)傷性股骨頭壞死不具備的

6、特點(diǎn)。TUNEL染色，激素性股骨頭壞死組的細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于創(chuàng)傷性股骨頭壞死組和對照組（P<0.001）；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)SIFHN氧化應(yīng)激8-OHdG染色和4-HNE染色的程度明顯高于創(chuàng)傷性股骨頭壞死和對照組（P<0.001）。
　　2.激素性股骨頭壞死的臨床患者RT-PCR和Western blot檢測高表達(dá)Nox4（P<0.001）；此外激素組 ASK1-p38/JNK的表達(dá)明顯高于創(chuàng)傷組和對照組（P<0.001）；激

7、素組呈現(xiàn)出對于NADPH氧化酶的高表達(dá)，并高表達(dá)MAPK凋亡通路。
　　3.建立激素性股骨頭壞死模型，6周后激素性股骨頭壞死模型建立成功，空骨陷窩率明顯高于對照組（P<0.001）；TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，DPI和NAC治療組細(xì)胞凋亡系數(shù)明顯低于激素組（P<0.001）；免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，DPI和NAC治療組8-OHdG和4-HNE氧化應(yīng)激損傷程度明顯低于激素組（P<0.001）；
　　4.分子生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NAC和DPI

8、治療組的ASK1，p38，JNK的mRNA表達(dá)和蛋白的表達(dá)明顯低于激素組（P<0.001）；顯微CT顯示NAC和DPI治療組的骨小梁結(jié)構(gòu)明顯優(yōu)于激素組（P<0.001）；
　　結(jié)論：
　　激素性股骨頭壞死患者股骨頭中細(xì)胞凋亡為主要的病理特點(diǎn)，并伴有大量的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)。Nox4可能是激素股骨頭壞死中氧化應(yīng)激的主要途徑。ASK1-p38/JNK信號途徑可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要凋亡通路。大鼠激素性股骨頭壞死模型中通過R