早期激素性股骨頭壞死的氫氣干預(yù)研究及機制探討.pdf

1、研究背景：
　　股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)長期以來一直是骨科領(lǐng)域的一種難治性疾病，其發(fā)病機制至今尚未形成定論，多種病因均能引起股骨頭局部血運、細(xì)胞功能以及骨修復(fù)機制的障礙，從而導(dǎo)致ONFH，進(jìn)而造成股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙。由于ONFH病程較長、早期病情比較隱匿容易被忽視，臨床上很大一部分患者就診時病情已經(jīng)是中晚期，此時最為可靠、確切、有效的治療方式只有人工關(guān)節(jié)置換，

2、但由于ONFH好發(fā)于30～50歲的中青年人群，人工關(guān)節(jié)置換的遠(yuǎn)期療效尚不能令人滿意，而且目前人工關(guān)節(jié)置換價格不菲、不同術(shù)者的手術(shù)效果差異明顯、仍存在一些手術(shù)風(fēng)險等，因此，如何在早期對ONFH進(jìn)行干預(yù)治療，延緩、阻止甚至逆轉(zhuǎn)病情發(fā)展，最大限度的保留原股骨頭功能，避免人工關(guān)節(jié)置換成為很多研究者關(guān)注的熱點問題。
　　激素性O(shè)NFH是非創(chuàng)傷性O(shè)NFH中最為常見的一種類型，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮細(xì)胞損傷在病情的

3、發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，多方面的病理機制共同作用，導(dǎo)致了股骨頭內(nèi)部骨代謝、骨重塑的異常，進(jìn)而引起股骨頭塌陷和關(guān)節(jié)功能障礙。氫氣的選擇性抗氧化作用以及作為一種新型氣體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的可能性近年來得到廣泛研究。已有大量研究表明，氫氣能有效調(diào)節(jié)局部組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平、減少組織損傷、保護組織細(xì)胞，并有可能參與凋亡相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)。目前有關(guān)利用氫氣的生理學(xué)作用對激素性O(shè)NFH進(jìn)行干預(yù)的研究尚未見報道。因此，本研究擬通過體外細(xì)胞實驗觀察氫氣對

4、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞生長的影響，探討氫氣對骨組織細(xì)胞的可能作用機制;繼而在早期激素性O(shè)NFH動物模型中觀察氫氣吸入對骨壞死區(qū)域微結(jié)構(gòu)的影響，檢測局部凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞因子以及氧化應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)情況從而探討氫氣對早期激素性O(shè)NFH的作用機制，為探索一種簡單、有效的早期ONFH治療方法提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　第一部分早期激素性股骨頭壞死動物模型的誘導(dǎo)與評價
　　目的：通過激素聯(lián)合內(nèi)毒素（脂多糖）誘導(dǎo)建立兔早期ONFH模型

5、，運用影像學(xué)和組織學(xué)技術(shù)觀察并評價誘導(dǎo)ONFH的實驗效果。
　　方法：健康雄性新西蘭大白兔20只，隨機分為模型組14只和對照組6只，模型組動物經(jīng)耳緣靜脈注射脂多糖(8μg/kg)2次，后經(jīng)肌肉注射甲潑尼龍（20mg/kg）3次，對照組注射等量的生理鹽水，6周后行雙髖關(guān)節(jié)X線和MRI檢查，隨機處死模型組動物6只和全部對照組動物，取股骨頭標(biāo)本后制備切片行組織學(xué)觀察，評估骨壞死表現(xiàn)，并計數(shù)兩組骨小梁區(qū)的空骨陷窩率進(jìn)行分析比較。
　

6、　結(jié)果：誘導(dǎo)6周后，X線檢查可見模型組股骨頭外形完整，股骨頭和股骨近端皮質(zhì)變薄、骨質(zhì)密度欠均勻、可見點狀或線狀密度減低影。模型組MRI顯示T1WI表現(xiàn)為點狀、細(xì)線狀、片狀低信號，T2WI表現(xiàn)為點狀、細(xì)線狀、片狀高信號或低信號，F(xiàn)S T2WI中以股骨頭區(qū)域或股骨近端不均勻的點狀或片狀的低信號區(qū)為主，伴有少量積液。HE染色可見模型組骨小梁變細(xì)稀疏、排列紊亂、部分骨小梁斷裂，骨細(xì)胞形態(tài)變化明顯、多見核固縮，空骨陷窩廣泛存在;骨髓內(nèi)多見壞死液化

7、區(qū)，脂肪細(xì)胞增多、形態(tài)不規(guī)則、部分融合成大泡?？展窍莞C率計數(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)LPS+MPS誘導(dǎo)后，股骨頭組織內(nèi)的空骨陷窩明顯增加（P＜0.05）。
　　結(jié)論：應(yīng)用激素聯(lián)合內(nèi)毒素能誘導(dǎo)出典型的兔早期ONFH模型，成功率高，重復(fù)性好，為進(jìn)一步研究氫氣干預(yù)激素性O(shè)NFH提供了動物模型基礎(chǔ)。
　　第二部分分子氫對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖和活性的影響
　　目的：初步觀察氫分子對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞生長和活性的影響。<

8、br>　　方法：使用飽和氫培養(yǎng)基對K7M2-WT小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞和RAW264.7小鼠單核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，MTT法觀察飽和氫培養(yǎng)基對兩種細(xì)胞增殖的影響，并使用PNPP法檢測ALP活性。在應(yīng)用RANKL誘導(dǎo)RAW264.7小鼠單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化時，使用飽和氫培養(yǎng)基對破骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用TRAP染色法觀察陽性多核破骨細(xì)胞形成情況并計數(shù)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：飽和氫培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞增殖率，以及成骨細(xì)胞ALP活

9、性均無明顯作用(P＞0.05);使用飽和氫培養(yǎng)基對RANKL誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞RAW264.7分化形成的成熟多核破骨細(xì)胞有抑制作用，能明顯減少TRAP陽性破骨細(xì)胞的數(shù)量(P＜0.05)。
　　結(jié)論：分子氫在正常生理條件下對成骨細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞的增殖和活性無明顯影響，但能明顯抑制RANKL誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化形成有功能活性的TRAP陽性多核破骨細(xì)胞。
　　第三部分氫氣吸入和髓芯減壓術(shù)治療兔早期激素性股骨頭壞死
　　目的：

10、通過氫氣吸入、髓芯減壓及兩者聯(lián)合對兔早期ONFH進(jìn)行干預(yù)治療，運用影像學(xué)、組織學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)觀察評估治療效果，并對其可能的作用機制進(jìn)行探討。
　　方法：應(yīng)用激素聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)建立兔早期ONFH模型，誘導(dǎo)6周后行MRI檢查，取影像學(xué)表現(xiàn)較為明顯的動物隨機分組后進(jìn)行后續(xù)實驗。共設(shè)6組:A.正常組(Norm組)，未行ONFH建模的正常動物;B.模型6周組（ONFH-6w組），經(jīng)LPS+MPS聯(lián)合誘導(dǎo)6周;C.模型14周組（ONFH-

11、14w組），建模成功后繼續(xù)飼養(yǎng)8周，不予干預(yù);D.氫氣吸入組（H2組），給予每日氫氣吸入40分鐘（濃度為4％）;E.髓芯減壓組(CD組)，給予鉆孔減壓手術(shù)處理;F.聯(lián)合處理組（H2+CD組），髓芯減壓術(shù)后給予氫氣吸入。建模8周后行髖關(guān)節(jié)X線檢查和MRI檢查，后對各組動物行股骨頭標(biāo)本取材:脫鈣后行組織切片(n=6)，行HE染色、TUNEL法檢測、免疫組化染色(CD31、TM);骨組織勻漿(n=6)，行生化檢測MDA含量、Western-b

12、lot法檢測Caspase-3表達(dá)、ELISA法檢測8-OHdG含量，比較所得各數(shù)據(jù)并行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：干預(yù)治療8周后，X線檢查和MRI顯示H2組、CD組、H2+CD組股骨頭影像學(xué)表現(xiàn)較治療前無明顯變化，ONFH-14w組部分動物影像學(xué)表現(xiàn)較8周前明顯進(jìn)展。HE染色顯示H2組、CD組、H2+CD組股骨頭空骨細(xì)胞陷窩率較治ONFH-14w組有明顯減少，且H2組、H2+CD組的空骨細(xì)胞陷窩率較ONFH-6w組減少，其差別有統(tǒng)計

13、學(xué)意義(P＜0.05);Western-blot法檢測Caspase-3相對含量和TUNEL法檢測凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量結(jié)果顯示，H2組、CD組、H2+CD組股骨頭內(nèi)Caspase-3相對含量和凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量均較ONFH-14w組減少，并且H2組、H2+CD組的Caspase-3相對含量和凋亡陽性細(xì)胞數(shù)量較CD組、ONFH-6w組均減少，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);MDA和8-OHdG的含量在H2組、H2+CD組中較CD組、ONFH

14、-6w組、ONFH-14w組明顯降低，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);免疫組化結(jié)果顯示CD31和TM染色陽性血管計數(shù)在H2組、CD組、H2+CD組中較ONFH-6w組、ONFH-14w組明顯增加，其差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而H2組、CD組、H2+CD組之間的血管計數(shù)并無明顯差別(P＞0.05)。
　　結(jié)論：氫氣吸入能明顯降低早期激素性O(shè)NFH后股骨頭內(nèi)氧化應(yīng)激水平、減少細(xì)胞凋亡、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。氫氣治療結(jié)合髓芯