鐵過(guò)負(fù)荷肝臟炎癥反應(yīng)與miR-146α-TRAF6-NF-κB信號(hào)通路關(guān)系研究.pdf

1、研究背景：
　　眾所周知，鐵作為人體的必需微量元素，在氧轉(zhuǎn)運(yùn)，能量代謝和DNA合成等多個(gè)生理過(guò)程中起著重要的作用。雖然鐵的攝入對(duì)機(jī)體是必不可少的，但是鐵攝入過(guò)多會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害，影響多種急慢性病癥的發(fā)生發(fā)展。肝臟作為鐵貯存的主要器官，在鐵代謝中發(fā)揮著中樞調(diào)節(jié)作用，鐵過(guò)負(fù)荷會(huì)對(duì)肝臟產(chǎn)生很大的危害。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵代謝紊亂可以引起肝臟炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致肝纖維化，肝細(xì)胞癌變或肝功能衰竭的重要原因之一。
　　過(guò)去研究表明，鐵過(guò)負(fù)荷fen

2、ton反應(yīng)，產(chǎn)生氧自由基，激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量炎癥因子，引起炎癥反應(yīng)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，鐵過(guò)負(fù)荷可以影響肝臟組織細(xì)胞microRNA表達(dá)變化。肝臟組織細(xì)胞miR-146α，122，155，132，34α在肝臟炎癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，肝鐵過(guò)負(fù)荷引起的miR-122表達(dá)降低，與肝臟的炎癥發(fā)生有關(guān)，但是過(guò)表達(dá)miR-122只能部分緩解肝鐵過(guò)負(fù)荷導(dǎo)致的炎癥，因此我們推測(cè)除了miR-122外，鐵過(guò)負(fù)荷還會(huì)影響到其他與

3、肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)的microRNA表達(dá)。
　　本課題首先利用芯片技術(shù)觀察不同鐵負(fù)荷2周小鼠肝臟基因和miRNAs表達(dá)變化特點(diǎn)，尋找目標(biāo)基因及其可能存在的相互聯(lián)系;在發(fā)現(xiàn)鐵過(guò)負(fù)荷可引起miR-146α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)變化基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析鐵過(guò)負(fù)荷肝細(xì)胞miR-146α表達(dá)下降的分子機(jī)制及其在肝臟炎癥反應(yīng)中的作用。
　　研究目的：
　　本課題通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，明確鐵過(guò)負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞內(nèi)與炎癥相關(guān)

4、的microRNA表達(dá)變化的特點(diǎn);篩選目標(biāo)microRNA（miR-146α等），并分析其在肝臟炎癥反應(yīng)中的作用;在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，闡明鐵過(guò)負(fù)荷引起目標(biāo)microRNA表達(dá)變化的機(jī)制，為尋找鐵過(guò)負(fù)荷相關(guān)疾病防治潛在靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理
　　（一）不同鐵負(fù)荷小鼠肝臟基因和miRNAs芯片檢測(cè)
　　將雄性C57小鼠隨機(jī)分為三組:缺鐵組(Iron defic

5、iency，ID)，對(duì)照組(Control，CTRL)，鐵過(guò)負(fù)荷組(Iron overload，IO)，三組小鼠自由飲水（去離子水）。進(jìn)食純化飼料（含鐵量3ppm/kg，成分組成見(jiàn)附錄），對(duì)照組小鼠按照20mg/kg腹腔注射右旋糖酐鐵（濃度為2mg/ml），每周兩次;鐵過(guò)負(fù)荷組小鼠按照200mg/kg腹腔注射右旋糖酐鐵（濃度為20mg/ml），每周兩次。缺鐵組小鼠按照相同體積腹腔注射0.9％生理鹽水，每周兩次。連續(xù)2周造模，麻醉處死小鼠

6、，收集肝臟組織樣本。
　?。ǘ╄F過(guò)負(fù)荷對(duì)肝臟miR-146α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的影響
　　1.不同鐵制劑對(duì)小鼠肝臟炎癥反應(yīng)的影響
　　將雄性C57小鼠隨機(jī)分為以下四組:對(duì)照組(Control，CTRL)，右旋糖酐組(Dextran，DEXT)，右旋糖酐鐵組(Dextran-iron，DEIR)和蔗糖鐵組(Sucrose-iron，SUIR)，均喂食全價(jià)飼料。按照同上方法連續(xù)4周造模，麻醉處死小鼠

7、，收集肝臟組織樣本。
　　2.鐵過(guò)負(fù)荷不同時(shí)間段對(duì)肝臟炎癥影響
　　將雄性C57小鼠隨機(jī)分為兩組:對(duì)照組(Control，CTRL)，鐵過(guò)負(fù)荷組(Ironoverload，IO)，所有小鼠均喂養(yǎng)純化飼料，每組又分為三個(gè)亞組:飼養(yǎng)1周組，飼養(yǎng)2周組，和飼養(yǎng)4周組。按照同上方法造模，麻醉處死小鼠，收集肝臟組織樣本。
　　二、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　?。ㄒ唬┘?xì)胞株的選擇
　　人肝癌細(xì)胞Huh7，HepG2，LX-2培養(yǎng)

8、在含10％胎牛血清，1％雙抗（青鏈霉素混合液）的高糖DMEM中，人肝細(xì)胞L02培養(yǎng)在含10％胎牛血清，1％雙抗的高糖1640中。
　?。ǘ┓纸M
　　按照實(shí)驗(yàn)的要求，選擇相應(yīng)的細(xì)胞株，進(jìn)行不同時(shí)間、不同濃度的暴露后收集細(xì)胞備用。
　　（三）轉(zhuǎn)染
　　將Huh7細(xì)胞或HepG2細(xì)胞接種到培養(yǎng)板上，當(dāng)融合度為80％時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用DMEM或1640培養(yǎng)液將過(guò)表達(dá)目的基因或miRNA和抑制目的基因或miRNA的inhi

9、bitor或干擾小RNA稀釋后混勻，37℃孵育15-20分鐘。根據(jù)使用的培養(yǎng)板，先在每孔中加入不含雙抗的培養(yǎng)液，再加入混合液，37℃孵育，6-8h后換新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)后48h后用做實(shí)驗(yàn)。
　　二、基因和microRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)
　　采用Affymetrix GeneChip Mouse Gene1.0 ST Array和miRNA3.0 Array，分別檢測(cè)鐵過(guò)負(fù)荷2周組和對(duì)照2周組C57小鼠肝臟基因和microRNA

10、s，表達(dá)，然后采用隨機(jī)方差模型(RVM)來(lái)進(jìn)行差異基因和microRNA篩選，分析工具為MultiClassDif。
　　四、血清鐵相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定
　　全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALT、AST、血清鐵、TIBC、TS的水平。
　　五、小鼠肝臟普魯士藍(lán)染色方法
　　肝臟樣本在4％多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，然后包埋，切片，最后用普魯士藍(lán)染色，顯微鏡鏡下觀察，并采集圖像。
　　六、小鼠肝臟HE染色及炎癥病理評(píng)分方法

11、r>　　肝臟樣本4％多聚甲醛固定，包埋，切片后，用蘇木精和伊紅染色，顯微鏡鏡下觀察，并采集圖像，采用Knodell法進(jìn)行肝臟炎癥病理評(píng)分。
　　七、實(shí)時(shí)定量熒光PCR
　　提取肝臟或細(xì)胞總RNA測(cè)定濃度后，反轉(zhuǎn)成CDNA，將cDNA與引物，SYBRgreen除酶水一起配好反應(yīng)體系后實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)CT值進(jìn)行分析。
　　八、Western-blot
　　提取肝臟組織或細(xì)胞總蛋白并測(cè)定濃度后，變性，凝膠電

12、泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗，二抗孵育后，顯影。
　　九、染色質(zhì)免疫共沉淀法(ChIP)
　　Huh7接種到培養(yǎng)皿中，一組加PBS作為對(duì)照，另一直加holo-tf，孵育24h后，分別進(jìn)行細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎，蛋白/DNA沉淀，洗脫，DNA純化，PCR擴(kuò)增目的基因，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　十、數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用（(X)±SEM）表示。使用Quantity one圖像分析系統(tǒng)分析Western blot條帶;應(yīng)

13、用Graphpad Prism6.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析(one-way ANVOA)分析各組之間的差異，各組間兩兩比較采用Tukeypost-hoc檢驗(yàn)。結(jié)果以P＜0.05為顯著性水平。
　　結(jié)果：
　　一、不同鐵負(fù)荷小鼠肝臟基因和miRNAs芯片檢測(cè)
　　（一）不同鐵負(fù)荷小鼠肝臟基因表達(dá)譜檢測(cè)
　　通過(guò)基因芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同鐵負(fù)荷2周小鼠肝臟有3282個(gè)基因表達(dá)出現(xiàn)差異，

14、其中中包括NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子TLR4、TRAF6、NF-κBia顯著升高，鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子鐵調(diào)素(HAMP)，鐵蛋白輕鏈(FTL1)顯著升高，而轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TRFC）顯著降低。
　?。ǘ┎煌F負(fù)荷小鼠肝臟microRNAs變化
　　鐵負(fù)荷2周后，缺鐵組，對(duì)照組和鐵過(guò)負(fù)荷組小鼠肝臟中有差異的microRNA有68種，其中包括TRAF6的調(diào)控因子miR-146α，說(shuō)明miR-146α可能跟肝臟炎癥有關(guān)。
　?。ㄈ?/p>

15、）PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，miR-146α表達(dá)明顯降低，鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子出現(xiàn)明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)小鼠肝臟處于鐵過(guò)負(fù)荷狀態(tài)，NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子TLR4，TRAF6表達(dá)升高，上述結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。
　　二、鐵過(guò)負(fù)荷對(duì)肝臟miR-146α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路的影響
　?。ㄒ唬┎煌F制劑對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)的影響
　　為了進(jìn)一步確定急性IO（而不是鐵劑的其它結(jié)合成分）可引起肝

16、組織炎癥反應(yīng)，建立正確的鐵過(guò)負(fù)荷小鼠模型，我們比較了右旋糖苷（鐵載體）、右旋糖酐鐵、蔗糖鐵，對(duì)小鼠肝鐵蓄積和炎癥的影響，結(jié)果表明，與對(duì)照組和右旋糖酐組相比，注射右旋糖酐鐵和蔗糖鐵組小鼠均能提高血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，和肝臟鐵，血清鐵蛋白水平，同時(shí)肝臟出現(xiàn)明顯鐵蓄積和炎癥反應(yīng)，我們選取右旋糖酐鐵作為鐵過(guò)負(fù)荷制劑，建立小鼠鐵過(guò)負(fù)荷模型。
　?。ǘ╄F過(guò)負(fù)荷不同時(shí)間段小鼠肝臟鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子，miR-146α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通

17、路和下游炎癥因子的表達(dá)變化
　　為了進(jìn)一步觀察整體水平肝組織miR-146α表達(dá)變化在IO引起炎癥過(guò)程中的作用，我們比較了1，2，4周鐵過(guò)負(fù)荷小鼠穩(wěn)態(tài)調(diào)控基因，miR-146α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路和下游炎癥因子的表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1-4周鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子基因出現(xiàn)相應(yīng)變化，同時(shí)可見(jiàn)miR-146α下降，NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子基因和蛋白表達(dá)升高，與芯片結(jié)果一致。
　　三、鐵過(guò)負(fù)荷影響miR-14

18、6α/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路的分子機(jī)制
　　（一）鐵過(guò)負(fù)荷miR-146α表達(dá)降低對(duì)肝細(xì)胞TRAF6/NF-κB信號(hào)通路活性的影響
　　1、不同濃度Holo-tf對(duì)Huh7細(xì)胞miR-146α表達(dá)影響
　　為了確定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)Holo-Tf的劑量，我們將Huh7細(xì)胞分別暴露于0，15，30，60μM濃度下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30μM Holo-tf就可以誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞miR-146α降低。
　　2、鐵過(guò)負(fù)荷對(duì)不

19、同人肝細(xì)胞株miR-146α表達(dá)影響
　　為了確定鐵過(guò)負(fù)荷引起的miR-146α變化是否存在細(xì)胞特異性，我們將在Huh7，HepG2，L02，LX-2細(xì)胞在含30μM Holo-Tf細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鐵過(guò)負(fù)荷可引起上述細(xì)胞株鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子表達(dá)發(fā)生相應(yīng)變化，同時(shí)伴有miR-146α明顯下降。
　　3、鐵過(guò)負(fù)荷引起miR-146α降低對(duì)TRAF6/NF-κB信號(hào)通路活性的影響
　　Huh7和HepG2細(xì)胞

20、在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，結(jié)果顯示上述細(xì)胞miR-146α表達(dá)降低，NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子TLR4，TRAF6，MYD88，p65、炎癥因子TNFα，IL6蛋白和mRNA表達(dá)升高。
　　為了了解鐵過(guò)負(fù)荷狀態(tài)下，miR-146α與TRAF6/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)的時(shí)間順序，我們將huh7細(xì)胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液分別暴露0，2，4，8，12，24，36，48h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pri-m

21、iR-146α和miR-146α表達(dá)在2h開(kāi)始降低，并隨著時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步降低;而TLR4，TRAF6，p65表達(dá)在12h開(kāi)始升高，TNFα和IL-6的表達(dá)在24h開(kāi)始升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步升高。
　　4、過(guò)表達(dá)miR-146α對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷下huh7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子的影響
　　為了明確鐵過(guò)負(fù)荷miR-146α表達(dá)變化與NF-κB信號(hào)通路活性變化的關(guān)系，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)miR-146α，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR

22、-146α，可以抑制鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子TRAF6，可以部分抑制下游炎癥因子表達(dá)升高幅度。而同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-146α，122可以明顯緩解鐵過(guò)負(fù)荷引起的TNFa升高。
　　（二）鐵過(guò)負(fù)荷引起肝細(xì)胞mir-146α表達(dá)下降的分子機(jī)制
　　1、鐵過(guò)負(fù)荷下引起miR-146α表達(dá)變化的轉(zhuǎn)錄因子篩選
　　將huh7和hepG2細(xì)胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，結(jié)果顯示，鐵過(guò)負(fù)荷對(duì)轉(zhuǎn)錄

23、因子STAT3，PU.1，CEBPβ表達(dá)無(wú)影響，HNF4α表達(dá)明顯降低，將huh7細(xì)胞在在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液分別暴露0～48h，結(jié)果HNF4α在2h明顯下降，隨著鐵過(guò)負(fù)荷時(shí)間的延長(zhǎng)，HNF4α表達(dá)逐步降低。
　　2、轉(zhuǎn)錄因子HNF4α對(duì)miR-146α表達(dá)的調(diào)控作用
　　首先通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HNF4α，huh7細(xì)胞miR-146α表達(dá)升高;抑制HNF4α，miR-146α表達(dá)降低;然后將過(guò)表達(dá)HNF4

24、α的Huh7細(xì)胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，與空載質(zhì)粒組相比，miR-146α表達(dá)明顯下降。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鐵過(guò)負(fù)荷時(shí)huh7細(xì)胞HNF4α與miR-146α結(jié)合活性明顯減弱。
　　3、HIF1α和miR-34α表達(dá)變化對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷下肝細(xì)胞HNF4α表達(dá)的影響
　　為了進(jìn)一步闡明鐵過(guò)負(fù)荷引起HNF4α/miR-146α表達(dá)降低的機(jī)制，我們檢測(cè)了鐵過(guò)負(fù)荷狀態(tài)下對(duì)HNF4α調(diào)控因子表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)

25、結(jié)果表明與對(duì)照組相比，鐵過(guò)負(fù)荷狀態(tài)下c-fos，c-jun，TCF4等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)無(wú)明顯變化，但鐵過(guò)負(fù)荷可以引起對(duì)HNF4α有負(fù)性調(diào)控作用的miR-34α表達(dá)明顯增加。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34αinhibitor，發(fā)現(xiàn)抑制了miR-34α表達(dá)，HNF4α表達(dá)明顯升高。
　　已知，具有鐵感受作用的HIF1α對(duì)miR-34α存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。因此，我們通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HIF1α，huh7細(xì)胞miR-34α表達(dá)升高，

26、HNF4α和miR-146α明顯降低;抑制HIF1α，miR-34α表達(dá)明顯降低，HNF4α和miR-146α表達(dá)明顯升高;在此基礎(chǔ)上抑制HIF1α的Huh7細(xì)胞在添加30μM Holo-tf培養(yǎng)液暴露24h，與空載質(zhì)粒組相比，HNF4α表達(dá)明顯升高。
　　結(jié)論：
　　一、miR-146α表達(dá)降低，TRAF6/NF-κB(p65)依賴性炎癥因子的表達(dá)升高，是鐵過(guò)負(fù)荷引起肝臟組織細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的重要途徑之一;
　　二、