MicroRNA-146a通過抑制TRAF6-NF-κB通路減輕椎間盤細胞炎癥反應(yīng).pdf

1、本研究擬通過體內(nèi)和體外實驗，從分子水平來研究探討MicroRNA-146a在椎間盤退變性疾病中的調(diào)控機制，尋找MicroRNA-146a與TRAF6/NF-κB信號通路交互作用功能分子，為脊椎退變性病變尋找新的治療靶標。本研究提出MicroRNA-146a過表達可以通過抑制TRAF6/NF-κB通路減輕椎間盤退變炎癥反應(yīng)的假設(shè)，期待通過相應(yīng)的后期實驗證明MicroRNA-146a可作為治療椎間盤退變的一個新靶點。
　　目的:

2、>　　1.研究MicroRNA-146a在椎間盤退變患者體內(nèi)的表達水平，進一步探討椎間盤退變與MicroRNA-146a表達水平的關(guān)系。
　　2.通過人髓核細胞體外實驗，研究分析MicroRNA-146a和TRAF6、NF-κB的相關(guān)性，進一步探討MicroRNA-146a、炎性通路、椎間盤退變?nèi)咧g的關(guān)系。
　　方法:
　　1.研究對象選自2013年5月至2014年3月在山東省立醫(yī)院就診患者及健康體檢人員，分為三組

3、;組一為椎間盤退變患者組，共21例，其中男12例，女9例;年齡18-30歲，平均25.6歲;組二為其他脊柱疾病患者組，共21例，其中男11例，女10例;年齡18-31歲，平均26.1歲;組三為對照組，健康體檢人群21例。其中男13例，女8例;年齡18-32歲，平均26.7歲。三組人群在年齡，男女比例等方面均無明顯差異，具有可比性(P＞0.05)。實時定量PCR(Quantitive Real-Time PCR，qRT-PCR)比較三組對

4、象外周血單核細胞中MicroRNA-146a水平，ELISA法比較三組對象血清NF-κB、TNF-α和IL-1的水平。將所有得到的結(jié)果數(shù)據(jù)資料輸入SPSS18.0軟件來進行統(tǒng)計分析，用均數(shù)±標準差((x)±s)形式來表示實驗數(shù)據(jù)資料，用成組t檢驗方法來對組間均數(shù)進行比較，如果P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.選擇人髓核細胞株(Nucleus Pulposus Cells，NP-CELLS)，HNPC4800，放置在DMEM

5、培養(yǎng)基中，并在溫育箱中進行培養(yǎng)。載體系統(tǒng)的組成包含了載體成分和包裝成分:MicroRNA-146a mimic（模擬物）和不含有MicroRNA-146a的空白質(zhì)粒;包裝質(zhì)粒pHelper1.0和pHelper2.0。這些包裝質(zhì)粒提供了病毒包裝所需要的結(jié)構(gòu)蛋白和包膜蛋白。將NP細胞根據(jù)本實驗要求因素的不同，進行相應(yīng)不同的干預(yù)和處理，總共分為以下4組:MicroRNA-146a組給予包含NPMicroRNA-146a siRNA序列的載體

6、干預(yù);NC(Negative Control，NC)組給予包含不對任何基因產(chǎn)生干擾作用的無意義陰性對照;LPS(Lipopolysaccharide，LPS，脂多糖)組是對siRNA序列的載體干預(yù)的細胞進行LPS刺激;BL組是空白細胞組，只在相同的培養(yǎng)條件下觀察而不做任何干預(yù)處理。將所有實驗細胞在處理時均設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染人髓核細胞(NP cells)，測試轉(zhuǎn)染率，經(jīng)LPS(10μM)刺激以誘導(dǎo)炎癥。qRT-PCR檢測MicroRNA-

7、146a在NP cells中的表達水平，用qRT-PCR和Western blot檢測NP cells中的TNF-α、TRAF6和NF-κB的基因和蛋白表達，以及MicroRNA-146a和TNF-α、TRAF6和NF-κB的相關(guān)性。實驗重復(fù)3次，電腦掃描記錄實驗結(jié)果的X光膠片，BandScan5.0圖像分析軟件讀取膠片上各蛋白條帶的灰度值，內(nèi)參數(shù)為β-actin，在本實驗中將目的蛋白的相對表達量用目的條帶和空白對照條帶比值的形式來表示

8、，所有實驗數(shù)據(jù)資料均采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件來進行分析處理，本實驗中的數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)±標準差((X)±s)的形式來表示。在本實驗中，兩組間的比較采用的是兩個獨立樣本t檢驗方法，多組別間的比較采用的是單因素方差分析(One Way ANOVA)方法，如果P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.三組研究對象的MicroRNA-146a表達水平比較，椎間盤退變患者組的MicroRNA-146a表達為1.092

9、±0.453mol/L，明顯低于其他兩組（其他脊柱疾病患者組2.871±1.265mol/L，對照組3.122±2.132mol/L），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。而對照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。三組研究對象的NF-κB表達水平比較，椎間盤退變患者組表達為137.52±11.45mg/L，明顯高于其他兩組（其他脊柱疾病患者組25.12±10.36mol/L，對照組28.11±3.87mol/L

10、），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而對照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。三組研究對象的TNF-α表達水平比較，椎間盤退變患者組表達為257.12±10.43mg/L，明顯高于其他兩組(其他脊柱疾病患者組127.21±21.37mol/L，對照組118.12±7.56mol/L)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而對照組和其他脊柱疾病患者組相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。而三組的IL-1表達

11、水平相比（椎間盤退變患者組124.27±11.25mol/L，其他脊柱疾病患者組110.34±7.57mol/L，對照組120.12±4.58mol/L)，差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。以上實驗結(jié)果顯示，椎間盤退變患者組MicroRNA-146a表達量明顯低于其他脊柱疾病患者組及對照組，且NF-κB、TNF-α表達量明顯高于其他兩組。
　　2.將已經(jīng)線性化的MicroRNA-146a mimic載體與合成的DNA olig

12、o經(jīng)過連接及轉(zhuǎn)化，然后將含有NP-siRNA序列的重組質(zhì)粒抽取出來之后再經(jīng)過測序，實驗結(jié)果顯示重組質(zhì)粒符合對本研究的設(shè)計要求。本實驗將攜帶增強型綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)報告基因的載體MicroRNA-146a mimic進行包裝而成為載體顆粒，當感染細胞后而在其中表達EGFP，在倒置熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)其發(fā)綠色熒光。然后進行相應(yīng)的的預(yù)實驗條件篩查后表現(xiàn)為，在6孔板中每孔細

13、胞數(shù)為1×105個，觀察到細胞融合度在轉(zhuǎn)染時可以達到30％—50％，并且當感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=50，polybrene5ug/mL的時候可以得到較高的感染效率。
　　將各組細胞的總RNA抽提后，再用2％瓊脂糖凝膠、100V恒壓電泳進行實驗，研究結(jié)果表明，本實驗中總RNA的完整性均較好，其中RNA顯示的3條帶亮度分別是28S＞18S＞5S，如圖3。然后通過核酸蛋白檢測儀進行相應(yīng)檢測

14、，結(jié)果表明本實驗總的RNA沒有發(fā)生降解，并且RNA的純度也滿足本研究要求，其實驗樣本的光密度值OD260/OD280在1.8～2.0之間。qRT-PCR檢測MicroRNA-146a，TRAF6和NF-κB等基因表達水平結(jié)果顯示，MicroRNA-146a的低表達和TRAF6、NF-κB的高表達有明顯的相關(guān)性。
　　使用Western blot方法來檢測分析本研究中各組細胞的蛋白表達水平，本實驗將3-actin作為內(nèi)參，將空白細胞

15、組在相同觀察時間點的表達量做為100％，并且利用以下公式來計算各組TRAF6及NF-κB的相對表達量:TRAF6及NF-κB的表達率(％)=100％×（干預(yù)組表達量/空白組表達量），在研究分析獲得的各組細胞TRAF6和NF-κB蛋白表達情況后，發(fā)現(xiàn)兩者之間在LPS組都顯示較高蛋白濃度，說明了這兩者與MicroRNA-146a的表達呈現(xiàn)相關(guān)性，抑制MicroRNA-146a的表達可以上調(diào)TRAF6和NF-κB的表達水平，說明MicroRN

16、A-146a與TRAF6和NF-κB之間呈負相關(guān)。MicroRNA-146a過表達可以顯著降低LPS刺激的NP細胞促炎性細胞因子的水平，并下調(diào)TRAF6和NF-κB的mRNA和蛋白表達水平。
　　結(jié)論:
　　1.MicroRNA-146a表達量可能與椎間盤細胞炎癥反應(yīng)相關(guān)。
　　2.MicroRNA-146a過表達可能會減輕椎間盤細胞炎癥反應(yīng)。
　　3.TRAF6/NF-κB途徑的關(guān)鍵因子、蛋白水平與MicroR