維生素E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、研究目的：
　　本課題通過(guò)動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察Vit.E補(bǔ)充對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響，為今后臨床上是否采用Vit.E補(bǔ)充這一方法防治鐵過(guò)負(fù)荷肝臟損傷相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法：
　　一、動(dòng)物分組與處理
　　24只雄性4周齡C57BL/6小鼠，按體重隨機(jī)分組:對(duì)照組(Ctrl)、鐵過(guò)負(fù)荷(IO)組、鐵過(guò)負(fù)荷+玉米油(IO+corn oil)組、鐵過(guò)負(fù)荷+Vit.E(IO+Vit.E)

2、組，每組6只。對(duì)照組腹腔注射0.9％生理鹽水，其余三組腹腔注射右旋糖酐鐵(20 mg/ml)，每次0.15ml，每周2次，共2周，總鐵量12 mg。IO+Vit.E組小鼠每天灌胃溶于玉米油的Vit.E(100mg/kg·bw)，IO+corn oil組小鼠每天灌胃與Vit.E等體積的玉米油，共2周，IO+corn oil作為溶劑對(duì)照組。
　　二、部分血清生化參數(shù)和肝鐵含量的檢測(cè)
　　采用全自動(dòng)血生化儀檢測(cè)各組小鼠血清中血清鐵

3、(SI)、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(TS)、總鐵結(jié)合力(TIBC)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等參數(shù)。硝化法測(cè)肝鐵含量。肝臟普魯士藍(lán)染色觀察肝鐵沉積情況。
　　三、肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測(cè)
　　ROS含量測(cè)定:制備小鼠肝臟組織勻漿液，離心吸取上清液，用ROS檢測(cè)探針DCF37℃避光孵育1h（DCF終濃度為5μM），酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
　　丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(

4、GSH)含量檢測(cè):肝臟組織勻漿處理，然后按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。
　　8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG):采用免疫熒光方法，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　四、肝臟HE染色及炎癥病理評(píng)分
　　肝臟組織用4％多聚甲醛固定，石蠟包埋。攤片，厚度為4μm，然后用蘇木精和伊紅染色。顯微鏡下觀察并拍照，按照1985年lok.Schener評(píng)價(jià)慢性肝炎合并HDV感染方法進(jìn)行炎癥病理評(píng)分。
　　五、細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　人肝癌細(xì)胞株Hu

5、h7細(xì)胞分為對(duì)照組、Holo-Tf組（Holo-transferrin）和Holo-Tf+Vit.E組。Holo-Tf組加入Holo-Tf（終濃度為30μM），Holo-Tf+Vit.E組同時(shí)加入Holo-Tf（終濃度為30μM）和Vit.E（終濃度為50μM），對(duì)照組加入無(wú)菌RNaseFree ddH2O，干預(yù)時(shí)間為24 h。
　　細(xì)胞羥自由基(·OH)含量、SOD活性、MDA含量、GSH含量的檢測(cè):細(xì)胞用添加Holo-Tf和V

6、it.E的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，制備肝細(xì)胞懸液，然后按說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行。
　　六、實(shí)時(shí)定量熒光PCR
　　用Trizol裂解組織或者細(xì)胞，按比例加入氯仿進(jìn)行萃取。離心取上層水相，用異丙醇沉淀RNA。75％乙醇將沉淀洗2遍，得到的白色絮狀沉淀即為RNA。加入20μl左右RNase Free ddH2O溶解。測(cè)RNA濃度，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照目的基因的正反引物及內(nèi)參基因正反引物，SYBR Green，cDNA，DEPC水進(jìn)行實(shí)

7、時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。動(dòng)物內(nèi)參為18S，細(xì)胞內(nèi)參為β-actin。根據(jù)擴(kuò)增得到的Ct值計(jì)算RQ值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　七、Western blot
　　肝臟組織或細(xì)胞加入蛋白裂解液（lysis buffer:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑:PMSF體積比為1 ml∶1μl∶10μl∶5μl）。經(jīng)勻漿、裂解、離心后，吸取蛋白上清液，然后上清液和loading buffer按4∶1比例進(jìn)行蛋白變性。用BCA試劑盒定量。蛋白經(jīng)電

8、泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，洗膜，加顯影液顯蛋白條帶，條帶進(jìn)行灰度分析，最終統(tǒng)計(jì)分析不同蛋白的表達(dá)情況。
　　八、統(tǒng)計(jì)和分析
　　數(shù)據(jù)用(x)±s表示，用SPSS21.0軟件分析。多組間比較采用方差分析。以P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　一、Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠和Huh7細(xì)胞鐵狀態(tài)的影響
　　1.小鼠的一般情況
　　IO組與對(duì)照組

9、比較，小鼠體重和進(jìn)食量無(wú)差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組比較，小鼠體重和進(jìn)食量無(wú)差異。IO+Vit.E與IO+corn oil組小鼠的體重和進(jìn)食量低于對(duì)照組。
　　2.小鼠的鐵負(fù)荷狀態(tài)
　　(1)小鼠血清鐵相關(guān)參數(shù)和肝鐵含量
　　(2)小鼠肝臟鐵代謝調(diào)節(jié)分子的表達(dá)變化
　　3.鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞鐵代謝調(diào)節(jié)分子表達(dá)變化
　　二、Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　?。ㄒ唬?/p>

10、Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟組織氧化應(yīng)激的影響
　　1.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟ROS、MDA、GSH含量和SOD活性的影響
　　與對(duì)照組比較，IO、IO+corn oil組肝臟ROS和MDA含量升高，而SOD活性和GSH含量降低。與IO組比較，IO+Vit.E組肝臟ROS和MDA含量降低，而SOD活性和GSH含量升高。
　　2.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟8-OHdG含量的影響
　　與對(duì)照組比較，IO、IO

11、+corn oil組肝臟8-OHdG熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。與IO組比較，IO+Vit.E組肝臟8-OHdG熒光強(qiáng)度減弱。
　?。ǘ￢it.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響
　　1.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞·OH含量的影響
　　與對(duì)照組相比，在添加30μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞內(nèi)·OH顯著升高;與單純Holo-Tf組相比，在添加30μM Holo-Tf同時(shí)分別添加0，25，50，1

12、00μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞內(nèi)·OH含量呈現(xiàn)不同程度的降低，有一定的量效關(guān)系，但50μM組與100μM的·OH含量沒(méi)有明顯差異。
　　2.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞MDA、GSH含量和SOD活性的影響
　　與對(duì)照組相比，在添加30μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞MDA含量升高，SOD活性和GSH含量降低。與單純Holo-Tf組相比，在添加30μM Holo-Tf同

13、時(shí)添加50μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞MDA含量有所降低，SOD活性和GSH含量有所升高。
　　三、Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷肝臟組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響
　?。ㄒ唬￢it.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟組織炎癥反應(yīng)的影響
　　1.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟炎性因子表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組比較，IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟p65，TNFα，IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)均升高。

14、與IO組比較，IO+corn oil、IO+Vit.E組之間小鼠肝臟p65，TNFα，IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　2.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠肝臟炎癥評(píng)分的影響
　　與對(duì)照組比較，IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠肝臟HE染色病理切片的炎癥評(píng)分均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間肝臟炎癥評(píng)分無(wú)顯著性差異。
　　3.Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷小鼠血清AST

15、、ALT水平的影響
　　與對(duì)照組比較，IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠血清AST、ALT水平均顯著升高。而IO、IO+corn oil、IO+Vit.E組小鼠之間血清AST、ALT水平無(wú)顯著性差異。
　　（二）Vit.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，在添加30μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞炎性因子p65，TNFα，IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)

16、均顯著升高。與單純Holo-Tf組相比，在添加30μM Holo-Tf同時(shí)添加50μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞p65，TNFα，IL-6 mRNA和蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　?。ㄈ￢it.E對(duì)鐵過(guò)負(fù)荷Huh7細(xì)胞HNF4α，miR-122，miR-146a，CCL2，TRAF6表達(dá)的影響
　　在添加30μM Holo-Tf的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞HNF4α，miR-122，miR-

17、146a表達(dá)顯著下調(diào)，miR-122和miR-146a的靶基因CCL2，TRAF6表達(dá)顯著升高。與單純Holo-Tf組相比，在添加30μM Holo-Tf同時(shí)添加50μM Vit.E的細(xì)胞培養(yǎng)液中暴露24h，Huh7細(xì)胞HNF4α，miR-122，miR-146a，CCL2，TRAF6表達(dá)無(wú)顯著性差異。
　　研究結(jié)論：
　　綜合本課題的研究結(jié)果，表明，鐵過(guò)負(fù)荷可引起肝臟組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng);Vit.E補(bǔ)充可以緩解鐵