大腸桿菌漆酶（CueO）的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、漆酶是一類廣泛存在于高等和低等生物中的古老酶類，其具有的多酚氧化能力和較寬松的底物特異性使其在造紙、環(huán)保、家具制造和食品生產(chǎn)等行業(yè)具有引人注目的應(yīng)用前景。但是由于天然漆酶生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低，一直無法滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求，高產(chǎn)、高活性重組漆酶的開發(fā)日益成為研究的焦點。CueO為大腸桿菌銅耐受系統(tǒng)重要組成蛋白，參與大腸桿菌周質(zhì)空間中的銅離子解毒過程；同時該蛋白也是一種細(xì)菌漆酶，可在重組條件下高量表達(dá)，但其氧化能力較真菌漆酶低1～2個數(shù)量

2、級。 我們通過克隆表達(dá)獲得CueO重組蛋白，并對其活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)CueO氧化活性依賴于外源銅離子的存在；為了說明這種依賴性的原因，我們通過懸滴氣相擴散法獲得了四種不同外源銅離子存在濃度條件下的CueO蛋白晶體，衍射、收集數(shù)據(jù)并最終解析獲得這四種晶體的三維結(jié)構(gòu)。通過結(jié)構(gòu)分析我們發(fā)現(xiàn)不同外源銅離子濃度條件下的晶體中CueO四個銅結(jié)合位點的占有率隨外源銅濃度升高依次遞增，結(jié)合氧化活性實驗結(jié)果可知，CueO氧化能力的銅離子依賴性源于

3、其銅結(jié)合位點的占有率不足。 將CueO三維結(jié)構(gòu)與其他三種已解析的漆酶結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，在CueO三核中心溶劑通道Glul06位殘基處，各種漆酶顯示出較大的疏水性差異，按照氧化活性最高的漆酶中的殘基種類將CueO蛋白106位突變?yōu)镻he后，觀察到突變體氧化活性對外源銅離子的依賴性較母體降低，表明該位置的疏水性對三核中心銅占有率有影響。同時，在四種漆酶的結(jié)構(gòu)比對中還發(fā)現(xiàn)CueO的底物口袋區(qū)域較其他漆酶多出一段α螺旋，阻礙了一型銅與底物的