重組胰蛋白酶大腸桿菌的發(fā)酵與表達(dá).pdf

1、胰蛋白酶是絲氨酸蛋白酶家族的重要成員，廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、制藥、臨床診斷、生化檢測(cè)等方面。在基因工程胰島素的生產(chǎn)中，胰蛋白酶能將胰島素原酶切為有活性的胰島素。目前胰蛋白酶主要從豬、牛的胰臟中提取，但因其動(dòng)物源性，存在未知病毒和外源因子污染的風(fēng)險(xiǎn)，且常因分離純化不徹底，存在其它酶類（如糜蛋白酶等）對(duì)底物非特異性酶切的危險(xiǎn)，故此種方法產(chǎn)生的胰蛋白酶在胰島素等蛋白藥物的生產(chǎn)和分析中的應(yīng)用受到較大的限制。通過(guò)基因重組技術(shù)獲得工程菌來(lái)表達(dá)胰蛋白酶

2、原，可以產(chǎn)生高純度與高活力的胰蛋白酶，滿足蛋白質(zhì)研究與藥物蛋白生產(chǎn)的需要。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。本文旨在探討胰蛋白酶在大腸桿菌中的表達(dá)，為其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。
　　本試驗(yàn)首先對(duì) NCBI中公布的胰蛋白酶原基因序列進(jìn)行了密碼子偏愛(ài)性優(yōu)化，將經(jīng)過(guò)優(yōu)化的胰蛋白酶原基因片段合成后連入 pET-22b(+)，構(gòu)建載體pET22b-Trypsinogen，對(duì)載體進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證后，再

3、將載體轉(zhuǎn)入宿主菌E.coli BL21(DE3)，獲得表達(dá)胰蛋白酶的工程菌，菌種命名為pET-proTYP。
　　然后，本試驗(yàn)對(duì)工程菌的形態(tài)和生化特征進(jìn)行了研究，并對(duì)工程菌傳代穩(wěn)定性進(jìn)行了全面考察，以確定工程菌在今后的使用中能夠穩(wěn)定傳代并表達(dá)目的蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明，重組胰蛋白酶工程菌具有典型的大腸桿菌形態(tài)和生化特征；經(jīng)傳代50代后，質(zhì)粒穩(wěn)定存在于菌種中，并能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，且工程菌傳代穩(wěn)定。
　　隨后，本試驗(yàn)對(duì)工程菌進(jìn)行誘

4、導(dǎo)表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶原主要以包涵體的形式表達(dá)。為獲得大量含胰蛋白酶原的包涵體，本試驗(yàn)對(duì)工程菌進(jìn)行了30L水平的高密度發(fā)酵，簡(jiǎn)單探究了高密度發(fā)酵的過(guò)程與控制。最終發(fā)酵結(jié)束后，通過(guò)離心得到了濕重102 g/L的菌體。對(duì)發(fā)酵情況進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示發(fā)酵后蛋白的表達(dá)量較高，通過(guò)灰度掃描顯示其表達(dá)量為23.2％。實(shí)現(xiàn)了高密度、高表達(dá)的細(xì)胞發(fā)酵目的。
　　最后，本試驗(yàn)對(duì)以包涵體形式存在的胰蛋白酶原進(jìn)行了變形和復(fù)性處理，經(jīng)

5、腸激酶酶切后獲得有活性的粗胰蛋白酶液，進(jìn)一步對(duì)粗酶切進(jìn)行純化，并對(duì)純化后的胰蛋白酶進(jìn)行酶活測(cè)定，最后對(duì)高活力、高純度的胰蛋白酶進(jìn)行冷凍干燥處理。最終確定了包涵體的復(fù)性條件為：蛋白濃度0.3 mg/mL，100 mM甘氨酸-氫氧化鈉體系，GSH/GSSG比例為1 mmol/L:0.3 mmol/L，復(fù)性緩沖液pH10。此條件下復(fù)性后粗酶液酶活可高達(dá)6200單位/mL。復(fù)性后的胰蛋白酶原經(jīng)過(guò)腸激酶過(guò)夜酶切，可以完全激活得到具有活性的胰蛋白酶

6、粗酶液。粗酶液經(jīng)過(guò)離子交換層析和疏水層析兩步純化，最后得到了純度達(dá)95％，比酶活達(dá)到每毫克10526 BAEE單位的胰蛋白酶。其純化條件經(jīng)優(yōu)化后為：疏水層析條件：緩沖液A-20 mM Tris-HCl+1.5M(NH4)2SO4，pH8.0；緩沖液B-20mM Tris-HCl，pH8.0；0-100％B線性梯度50CV。離子交換條件：緩沖液A-20mM Tris-HCl，pH8.0；緩沖液B-20mM Tris-HCl+1M NaCl