實驗大腸桿菌的培養(yǎng)與分離

1、實驗目的:,1.進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作2.進行大腸桿菌的分離,用固體平板培養(yǎng)基進行細菌的劃線培養(yǎng)3.說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和操作要求的原理,特點：結構都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細胞結構.且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進行光合作用.,一、基礎知識： (一)微生物,：是一切肉眼看不見或看不清楚的微小生物的總稱．,(二)細菌,1、結構,2、分裂

2、,3、生殖,4、變異類型,5、在基因工程中的應用,細菌的類型,大腸桿菌屬于桿狀菌,根據(jù)細菌所利用的能源和碳源的不同將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌 大部分病原菌,細菌的營養(yǎng)類型,,光能自養(yǎng)型:光合細菌化能自養(yǎng)型:硝化細菌,鐵細菌,硫細菌,大腸桿菌屬于異養(yǎng)兼性厭氧菌,細菌的革蘭氏染色,革蘭氏染色法是一種用于細菌的染色法。此法將細菌分為兩類，即革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。所謂革蘭氏陽性菌就是

3、用革蘭氏染液染色后，再用脫色液處理，細菌仍保留染色液的顏色；革蘭氏陰性菌則相反。這兩種菌的差別在于細胞壁的成分不同。,大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌,-------培養(yǎng)基,1.定義 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)液。,(三)細菌的培養(yǎng),2.培養(yǎng)基的五大營養(yǎng)成分：水、無機鹽、碳源、氮源、 生長因子等營養(yǎng)物質，另外還需要滿足微生物生長對pH 、氧氣、滲透壓的要求．,不同的微生物往往需要采用不同

4、的培養(yǎng)基配方：,細菌喜葷，霉菌喜素,大腸桿菌的配方： 酵母提取物   0.5g 蛋白胨   0.5g Nacl         0.5g 瓊脂 

5、0;      1g 水 50ml,3.培養(yǎng)基的類型,按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。,成分區(qū)別：是否加瓊脂,按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基,按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基,,液體培養(yǎng)基：擴增細菌、工業(yè)生產(chǎn)固體培養(yǎng)基：純化（分離），鑒定、保藏菌種,選擇培養(yǎng)基: 從微生物群中選擇具有特定表型的細胞.使之進行繁殖所用的培養(yǎng)基,稱為選擇

6、培養(yǎng)基.,加入青霉素的培養(yǎng)基: 分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基: 分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養(yǎng)基: 分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基: 分離自養(yǎng)型微生物,單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。,4、 菌落,液體培養(yǎng)

7、基：,表面生長,均勻混濁生長,沉淀生長,二、 無菌技術,1.無菌技術的概念,無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。,成功地培養(yǎng)微生物的關鍵。,（１）消毒定義：,2.消毒與滅菌的概念及兩者的區(qū)別,（2）滅菌的定義：,是指殺滅病原微生物的方法。,是指殺滅或清除環(huán)境中一切微生物（包括芽孢、孢子） 的方法,a. 煮沸消毒法: 100℃煮沸5-6minb. 巴氏消毒法： 70-75 ℃下煮30min或 80 ℃

8、下煮15minc. 化學藥劑消毒法: 用75%酒精進行皮膚消毒; 氯氣消毒水源；高錳酸鉀溶液；次氯酸鈉溶液等……,（3）常用消毒的方法：,a、灼燒滅菌,常用滅菌的方法：,b、干熱滅菌：160-170 ℃下加熱1-2h。c、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121 ℃下維持15min.,1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？,2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合

9、適的方法。（1） 培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2） 玻棒、試管、燒瓶和吸管（3） 實驗操作者的雙手,答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。,思考,1,二、大腸桿菌的培養(yǎng)和分離實驗操作,（一）培養(yǎng)基的配置與滅菌,取2個250ml的三角瓶中分別裝入50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB固體培養(yǎng)基（剛配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮紙包裝后高壓鍋滅菌15min。,LB液體培養(yǎng)基——

10、細菌的擴大培養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基——細菌的劃線分離,封口膜：既通氣又不使雜菌進入,（二）倒平板,滅菌后的培養(yǎng)基在無菌超凈臺上倒入4個培養(yǎng)皿中，倒后立即置于水平位置上，輕輕晃動，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，使之形成平面。,注意事項：1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到60 ℃左右時，才能用來倒平板2.滅菌及消毒：無菌超凈臺用紫外燈和過濾風滅菌；桌面及人手用酒精棉球消毒 3.操作時右手無名指和小指夾住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培養(yǎng)皿并打開

11、上蓋的一邊,在酒精燈火焰旁操作.4.需要使錐形瓶的瓶口通過火焰，灼燒滅菌5.平板冷凝后，要將平板倒置,既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染.,（三）大腸桿菌的擴大培養(yǎng),將斜面上培養(yǎng)的大腸桿菌菌種接種到滅菌后的液體培養(yǎng)基中,使其在37℃搖床上振蕩培養(yǎng)12小時。,注意事項:1.火焰旁從斜面上用接種環(huán)取菌;2.取菌前接種環(huán)要用酒精燈灼燒滅菌,冷卻后方能取菌;3.取菌后封口膜和棉塞復原.,1

12、、劃線分離法 在無菌操作臺上用接種環(huán)取菌種后在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線.,（四）大腸桿菌的分離,不能使用脫脂棉，否則容易吸水，造成污染。,,,,,,,,注意事項:1.接種環(huán)只蘸一次菌液, 但要在培養(yǎng)基的不同位置連續(xù)劃線多次。每次劃線前接種環(huán)都要灼燒滅菌。2.劃線首尾不能相接。3.劃線后, 培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)12~24h,分離后,一個菌體便會形成一個菌落,這是消除污染雜菌的通用方法,也是用于篩選高表達量菌株的最簡便方法之一

13、。,問題討論,1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？,答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單菌落。劃線結束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避

14、免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？,答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。,3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？,答：劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,（五）大腸桿菌分離后保存,1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保

15、存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法,2、涂布分離法:是指將培養(yǎng)的菌液稀釋一定的倍數(shù),然后取一定量稀釋液加在固體培養(yǎng)基上,用玻璃刮刀涂布在培養(yǎng)基平面上.,劃線分離法和涂布分離法哪個更好呢？,劃線分離：方法簡單，但單菌落較難分開。涂布分離：單菌落更易分開，但操作復雜。,1.如何操作才可以盡量避免被雜菌污染?,(1)膽大心細，操作快捷。（2）注意滅菌操作原則，滅菌徹底，降低環(huán)境污染概率。（3）注意微生物生長條件，如PH、滲透壓、溫度等。細菌

16、喜堿，喜蛋白質，喜37度；霉菌喜酸，喜糖，喜25-30度,2.在培養(yǎng)后如何判斷是否有雜菌污染?,（1）菌落的形態(tài)看，是否濕潤，透明，粘稠，顏色等。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（2）顯微鏡觀察其形態(tài)、大小、看是否有菌絲、孢子、芽孢。是區(qū)別細菌、酵母、放線菌和霉菌關鍵指標。（3）上述方法較難區(qū)別同類的不同物種，需借助化學和進一步的形態(tài)觀察，如用革蘭氏染色法等。,3.進行恒溫培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置?,恒溫培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中的

17、水分會以水蒸氣的形式蒸發(fā)，倒放培養(yǎng)皿則會使水蒸氣凝結成水滴留在蓋上；如果正放，則水分形成的水滴會落入培養(yǎng)基表面并擴散開。如果培養(yǎng)皿中已形成菌落，則會導致菌隨水擴散，很難再分成單菌落，達不到分離目的。,4.實驗完成后,接種過細菌的器皿應如何處理?,所有接觸過菌的器皿都要先高壓滅菌后再洗滌（特別是培養(yǎng)基）；使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄,5.如果分離的是轉基因的大腸桿菌,如何保證不被普通的大腸桿菌所污染?,轉基因用的質粒不是細菌中原有的