20826.肝素黃桿菌肝素酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究

1、DissertationSubmittedtoZhejiangGongshangUniversityforMaster’SDegreeofEngineeringHEPAR【]NFLAVOBACTERIUMHEPARANASEGENEEXPRESSIONINEC∞，Author：WuYaUMajor：BiochemicalEngineeringSupervisor：ProfPingYuroUJan2012●CollegeofFoodSci

2、ence&BiotechnologyEngineering，ZhejiangGongshangUniversityHangzhou，310035，ChinalIIIIIIIIIIIIrlIIIIIIIY2070356肝素黃桿菌肝素酶基因在大腸桿菌中表達(dá)的研究摘要肝素酶(heparanase，Hpa)是近年來(lái)研究較多的一類D糖苷內(nèi)切酶(endoD—glucuronidase)，它既存在于正常組織，如胎盤和淋巴器官，對(duì)胚胎的形成，神經(jīng)系統(tǒng)的

3、發(fā)育，新生血管的形成，炎癥反應(yīng)等都發(fā)揮著正常的生理功能；同時(shí)也表達(dá)于多種惡性腫瘤細(xì)胞的表面，能夠促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤血管生成，降低腫瘤患者的生存率。肝素用于治療和預(yù)防血栓已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，但是研究表明肝素有一定的副作用，例如影響血小板的穩(wěn)定，從而導(dǎo)致手術(shù)后大出血。而分子量在40008000的低分子量肝素(LMWH)貝J]能夠有效地治療血栓，但是沒(méi)有明顯的副作用。目前我國(guó)LMWH主要依靠進(jìn)口或者來(lái)自合資企業(yè)生產(chǎn)，因此LMWH的生

4、產(chǎn)研究具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。而肝素酶的重要用途之一便是用于生產(chǎn)LMWH。針對(duì)以上問(wèn)題，本課題組構(gòu)建了高效表達(dá)可溶性肝素酶的重組大腸桿菌系統(tǒng)，獲得了純度高，活力高，性質(zhì)穩(wěn)定的肝素酶，極大降低了肝素酶的生產(chǎn)成本，使得肝素酶用于LMWH的生產(chǎn)成為可能。本課題組己完成了以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)克隆表達(dá)黃桿菌肝素酶基因的工作，并以該基因作為起始材料，利用酶活測(cè)定方法篩選出高活力菌株；然后對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化；最后對(duì)重組蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化并研究其酶學(xué)