鈣、磷對體外培養(yǎng)SD大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化影響的研究.pdf

1、本試驗(yàn)選用5d SD大鼠頭蓋骨作為試驗(yàn)用OB的來源，通過胰蛋白酶預(yù)消化后，剪碎，經(jīng)II型膠原酶消化獲得細(xì)胞，采用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、鈣化結(jié)節(jié)染色鑒定，經(jīng)臺盼藍(lán)染色、“反復(fù)貼壁法”純化后，進(jìn)行了成活率和純度分析，用MTT法檢測了一個生長周期內(nèi)OB的活性分布，成功建立了SD大鼠頭蓋骨OB體外培養(yǎng)模型；在體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)液中添加不同濃度的鈣、磷及其比例，共分9組，分別為不添加任何成分的對照組

2、、添加1、2、4 mmol/L鈣組、添加1、2、4 mmol/L磷組、鈣磷比1:2(添加1 mmol/L鈣+2 mmol/L磷)組和鈣磷比2:1(添加2 mmol/L鈣+1 mmol/L磷)組。分別從OB的形態(tài)學(xué)、OB分泌ALP活性、OB分泌蛋白、I型膠原(collagen type I，Col-I))、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的含量、OB表達(dá)ALP、Col-I、OPN、骨鈣素(bone glaprotein，BGP)

3、 mRNA的含量及OB內(nèi)Ca2+沉積及體外鈣化等指標(biāo)進(jìn)行了分析，詳細(xì)的研究了鈣、磷及其比例對乳鼠頭蓋骨OB增殖、分化及礦化的影響。結(jié)果表明，①本試驗(yàn)培養(yǎng)的頭蓋骨OB，經(jīng)ALP染色鑒定，并計(jì)數(shù)，OB純度高達(dá)98.06％，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)分析，原代OB成活率為88.69％，傳代的OB成活率高達(dá)94.12％，且在一個生長周期內(nèi)，在第3、4d進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞融合并開始重疊生長，在第7d達(dá)到峰值，并進(jìn)入鈣化期，隨后細(xì)胞進(jìn)入衰減期。因此，本試驗(yàn)將

4、選擇在細(xì)胞融合時定為鈣、磷處理OB的時間點(diǎn)，檢測處理后第2、5、8d的各種指標(biāo)；②與對照組比較，添加鈣各組均促進(jìn)OB增殖，且有劑量效應(yīng)，鈣4 mmol/L從第2d開始差異顯著(P<0.05)，鈣1、2 mmol/L從第Sd開始差異顯著(P<0.05)，而鈣磷比(2:1、1:2)只在第8d差異顯著(P<0.05)。而添加磷對QB增殖作用影響不明顯。③與對照組比較，添加鈣使OB胞體飽滿，表面針狀突起增多，形態(tài)結(jié)構(gòu)無破損，細(xì)胞膜、核膜完整，線

5、粒體輕度腫脹，添加磷及不同鈣磷比使OB胞體扁平，針狀突起減少，但形態(tài)結(jié)構(gòu)無破損，細(xì)胞膜、核膜完整。④與對照組比較，添加鈣、磷及其比例在第2、5、8d均抑制細(xì)胞內(nèi)ALP活性(P<0.05)，在第5 d抑制其mRNA的表達(dá)(P<0.01)，但在第2、8 d卻促進(jìn)其mRNA的表達(dá)(P<0.05)。⑤與對照組比較，添加鈣、磷及其比例各試驗(yàn)組除1 mmol/L鈣外，在第2d均促進(jìn)Col-I分泌(P<0.01)，鈣各組和1 mmol/L磷在第5d和

6、鈣各組和1、2 mmol/L磷和鈣磷比(2:1)在第8 d均抑制其分泌(P<0.05或P<0.01)，在第2、8d均促進(jìn)其mRNA表達(dá)(P<0.01)，在第5 d除鈣磷比(1:2)外均抑制其mRNA表達(dá)(P<0.01)。⑥與對照組比較，添加鈣、磷及其比例作用后，各試驗(yàn)組均促進(jìn)OPN mRNA的表達(dá)(P<0.01)，除第2 d鈣1、2mmol/L組外，均促進(jìn)其分泌(P<0.05)。⑦與對照組比較，添加鈣、磷及其比例作用后，各試驗(yàn)組均促進(jìn)B