氟對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨鈣素基因表達(dá)的影響.pdf

1、為了探討氟化物對機(jī)體骨骼代謝的影響和骨鈣素(OCN)在氟中毒所致骨相損害中的作用，本研究采取酶完全消化法或酶半消化植塊培養(yǎng)法，以小鼠(初生24h)和胎羊(2～3月齡)頭蓋骨為材料分離成骨細(xì)胞，通過形態(tài)觀察(Giemsa染色)、堿性磷酸酶(ALP)和鈣化結(jié)節(jié)(VonKossa)染色來鑒定細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)；從體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出OCN基因序列，經(jīng)克隆、藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定后，進(jìn)行測序和生

2、物信息學(xué)分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR來檢測不同濃度NaF對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞OCN基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明： 1.在10mMβ-甘油磷酸鈉和50μg/mL維生素C誘導(dǎo)培養(yǎng)下，分離的小鼠、綿羊成骨細(xì)胞確實(shí)表達(dá)OCN基因。綿羊OCN基因編碼區(qū)全長297bp，較人和牛的OCNcDNA少3個(gè)核苷酸；BLAST-N分析表明與黃牛OCNmRNA序列的同源性為95％，與人的同源性為88％。綿羊OCN的測序結(jié)果已被GeneBank收錄，登錄號為D

3、Q418490。 2.成骨細(xì)胞在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)下，第3d即有OCNmRNA的表達(dá)，對照組和5×10-4mol/LNaF組分別在第7d和第11d達(dá)高峰；高峰過后OCNmRNA的表達(dá)急劇減少，之后則呈緩慢下降趨勢，至19d仍有表達(dá)。除了第7d，5×10-4mol/LNaF組OCN基因在各時(shí)間段的表達(dá)均較對照組高。另外，各濃度NaF均能刺激體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞OCN基因的表達(dá)，且呈劑量依賴關(guān)系，當(dāng)濃度為5×10-4mol/L時(shí)OCN基因表達(dá)