兩個水稻卷葉基因的精細定位和克隆.pdf

1、葉片是植物進行光合作用和呼吸作用的主要器官，對植物的生命活動起著重要的作用，葉片的發(fā)育作為植物形態(tài)建成的一個重要方面，關系到植物株型和農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的形成。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，卷葉性狀是超高產(chǎn)育種的一項重要形態(tài)指標。因此，探明卷葉形成的分子機理，不僅能使我們更多地了解水稻的葉發(fā)育機制，而且能幫助我們通過分子設計改良株型。 利用60Co-γ射線輻射水稻品種中花11，在M2代獲得了三份卷葉突變體：M425、M429和M47

2、5，在日本晴的組培后代中得到一份卷葉突變體M7。其中，M425和M7表型相似，葉片都表現(xiàn)筒狀卷曲，且籽?；?；M429和M475兩者表型相似，葉片半卷，籽粒增多呈密穗。本研究對這些卷葉突變體進行了形態(tài)觀察、突變性狀的遺傳分析、基因的等位性檢測及圖位克隆，主要研究結果如下： 一、水稻卷葉基因RL9的定位和克隆 1、對葉片細胞結構進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)r19-1突變體(M425)葉片小維管束遠軸面厚壁細胞缺失，葉肉細胞取而代

3、之，近軸面特有的茸毛在遠軸面也有分布，而且葉綠體發(fā)育異常，基粒片層排列紊亂。 2、將r19-1突變體與中花11配制雜交，F(xiàn)1植株葉片表現(xiàn)平展，F(xiàn)2中正常株和突變株的分離比符合3：1，表明突變性狀受單隱性基因控制。 3、利用r19-1突變體與秈稻品種Dular雜交產(chǎn)生的F2和F3群體，運用SSR、STS和CAPS標記，將RL9基因定位在第9染色體PAC克隆AP005904上22kb的區(qū)段上；此外，利用圖位克隆的方法分離

4、了一個與r19-1等位的突變基因r19-2，來自突變體M7。 4、通過基因預測發(fā)現(xiàn)，在RL9基因所在的22kb內(nèi)，僅有一個候選基因，預測編碼類似MYB的蛋白；對該基因的測序結果表明，r19-1在第一個外顯子中發(fā)生了5個堿基的缺失，引起移碼：r19-2在第一個內(nèi)含子和第二個外顯子的剪切位點處發(fā)生了1個堿基的替換，使內(nèi)含子不能被正確剪切，引起RL9閱讀框改變，導致RL9功能的喪失。 5、通過RT-PCR的方法確定了RL9

5、基因位于AP005904上103061-108515處，編碼區(qū)長兒34bp，編碼377個氨基酸，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子。 6、將來自日本晴BAC克隆的全長RL9基因?qū)雛19-1突變體后，r19-1恢復成野生型表型，證實RL9是控制M425卷葉性狀的基因。 7、半定量RT-PCR結果表明，RL9基因在植株所有器官中均有表達，在根、葉片和穗中的表達量較高，在莖和葉鞘中表達量較低。 8、對RL9所編碼的氨基

6、酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，RL9含有一個GARP結構域。 9、將RL9蛋白序列與數(shù)據(jù)庫中已命名的GARP超家族成員進行多序列比對，以鄰位相連法構建進化樹，發(fā)現(xiàn)RL9與擬南芥KANADI同源，根據(jù)KANADI在擬南芥中的功能，結合RL9功能喪失突變在水稻中的表現(xiàn)，推測RL9控制葉片的遠軸發(fā)育。 10、將RL9與GFP融合在洋蔥表皮瞬時表達，融合蛋白定位在細胞核內(nèi)，表明RL9是一個轉錄因子。 二、卷葉基因RL10的定

7、位和克隆 1、對葉片細胞結構進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)r100-1突變體(M429)葉片部分小維管束遠軸面的厚壁細胞缺失，并有少量類似C4植物的“花環(huán)”結構產(chǎn)生，而且近軸面所屬的茸毛在遠軸面也有分布。 2、將r110-1突變體與中花11配制雜交，F(xiàn)1植株葉片表現(xiàn)平展，F(xiàn)2中正常株和突變株的分離比符合3：1，表明突變性狀受單隱性基因控制。 3、利用r110-1突變體與秈稻品種Dular雜交產(chǎn)生的F2和F3群體，將RL

8、10基因定位在STS標記f70和f87之間約38kb的區(qū)段內(nèi)；同樣，利用圖位克隆的方法分離了一個與r110-1等位的突變基因r110-2，來自突變體M475。 4、通過基因預測發(fā)現(xiàn)，在RL10基因定位的38kb內(nèi)，存在5個基因，對它們進行測序分析發(fā)現(xiàn)，第二個基因在兩個突變體中發(fā)生了序列變化，r110-1在外顯子中發(fā)生了單堿基替換(T→C)，導致一個絲氨酸突變成脯氨酸，r110-2在終止密碼子前發(fā)生了兩個堿基的缺失，導致翻譯終止