葡萄兩個重要SBP基因的克隆、亞細胞定位及表達分析.pdf

1、葡萄屬于葡萄科葡萄屬植物,是世界性重要果樹之一。其基因組較小(約為500Mbp),大約是擬南芥基因組大小的3到4倍,同時也是繼擬南芥、水稻、楊樹之后完成全基因測序的第四種開花植物,因此葡萄已成為分子生物學(xué)研究的重點對象。
　　 真核生物轉(zhuǎn)錄因子是近幾十年來發(fā)現(xiàn)的一類在真核基因轉(zhuǎn)錄時起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì),有關(guān)研究相繼從高等植物中分離出一系列調(diào)控發(fā)育及逆境反應(yīng)等相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄因子。SBP轉(zhuǎn)錄因子是高等植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子,該家

2、族具有許多重要的生物學(xué)功能,例如:其在植物的生長發(fā)育過程中起重要作用。而關(guān)于葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的研究才剛剛起步,為進一步探索SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)與功能,本研究利用生物信息學(xué)對葡萄SBP家族進行了分析,并利用電子克隆及3'RACE技術(shù)克隆了夏黑葡萄SBP家族兩個基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全長,構(gòu)建了亞細胞定位表達載體,對其是否具有核定位功能的進行了研究,采用半定量和熒光定量RT-PCR方法分析這基因在葡萄不同組

3、織中的表達情況,同時研究了microRNA156a(Vv-miR156a)與這兩個基因表達之間的關(guān)系,對葡萄SBP家族的這兩個基因有了初步的認識,重要研究結(jié)果如下:
　　 1.葡萄SBP基因家族生物信息學(xué)分析,根據(jù)擬南芥SBP保守區(qū)域的蛋白序列在NCBI中檢索相匹配的序列,之后利用Pfam軟件檢索葡萄無冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,共得到45條葡萄候選SBP氨基酸序列,其中近半數(shù)具有葡萄microRNA156a(Vv-miR156a)識別位

4、點,之后又進行了基因定位、氨基酸組成成分、理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)分析,對葡萄SBP基因家族的性質(zhì)有了初步認識。
　　 2.利用電子克隆及3'RACE技術(shù)獲得了葡萄兩個SBP類轉(zhuǎn)錄因子基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全長,登錄號分別為HM018600和HM018601,cDNA全長分別為1649 bp和1709 bp。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因編碼的蛋白質(zhì)均具有SBP轉(zhuǎn)錄因子的典型特征,證明從葡萄上成功地分離出了擬南芥SP

5、L9和SPL10的同源基因Vv-SPL9和Vv-SPL10。
　　 3.構(gòu)建了Vv-SPL9和Vv-SPL10 GFP表達載體,并進行了亞細胞定位分析。結(jié)果顯示兩者都僅在核內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光,即表明Vv-SPL9和Vv-SPL10均具有核定位功能。
　　 4.利用半定量和熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了Vv-SPL9、Vv-SPL10和Vv-miR156a在葡萄不同組織中的表達,結(jié)果顯示這兩個基因在各個組織中均有表達,但量存在