葡萄兩個(gè)重要SBP基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析.pdf

1、葡萄屬于葡萄科葡萄屬植物,是世界性重要果樹(shù)之一。其基因組較小(約為500Mbp),大約是擬南芥基因組大小的3到4倍,同時(shí)也是繼擬南芥、水稻、楊樹(shù)之后完成全基因測(cè)序的第四種開(kāi)花植物,因此葡萄已成為分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)對(duì)象。
　　 真核生物轉(zhuǎn)錄因子是近幾十年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)在真核基因轉(zhuǎn)錄時(shí)起調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì),有關(guān)研究相繼從高等植物中分離出一系列調(diào)控發(fā)育及逆境反應(yīng)等相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。SBP轉(zhuǎn)錄因子是高等植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子,該家

2、族具有許多重要的生物學(xué)功能,例如:其在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。而關(guān)于葡萄SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的研究才剛剛起步,為進(jìn)一步探索SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)與功能,本研究利用生物信息學(xué)對(duì)葡萄SBP家族進(jìn)行了分析,并利用電子克隆及3'RACE技術(shù)克隆了夏黑葡萄SBP家族兩個(gè)基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全長(zhǎng),構(gòu)建了亞細(xì)胞定位表達(dá)載體,對(duì)其是否具有核定位功能的進(jìn)行了研究,采用半定量和熒光定量RT-PCR方法分析這基因在葡萄不同組

3、織中的表達(dá)情況,同時(shí)研究了microRNA156a(Vv-miR156a)與這兩個(gè)基因表達(dá)之間的關(guān)系,對(duì)葡萄SBP家族的這兩個(gè)基因有了初步的認(rèn)識(shí),重要研究結(jié)果如下:
　　 1.葡萄SBP基因家族生物信息學(xué)分析,根據(jù)擬南芥SBP保守區(qū)域的蛋白序列在NCBI中檢索相匹配的序列,之后利用Pfam軟件檢索葡萄無(wú)冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),共得到45條葡萄候選SBP氨基酸序列,其中近半數(shù)具有葡萄microRNA156a(Vv-miR156a)識(shí)別位

4、點(diǎn),之后又進(jìn)行了基因定位、氨基酸組成成分、理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)分析,對(duì)葡萄SBP基因家族的性質(zhì)有了初步認(rèn)識(shí)。
　　 2.利用電子克隆及3'RACE技術(shù)獲得了葡萄兩個(gè)SBP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因Vv-SPL9和Vv-SPL10的cDNA全長(zhǎng),登錄號(hào)分別為HM018600和HM018601,cDNA全長(zhǎng)分別為1649 bp和1709 bp。經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)均具有SBP轉(zhuǎn)錄因子的典型特征,證明從葡萄上成功地分離出了擬南芥SP

5、L9和SPL10的同源基因Vv-SPL9和Vv-SPL10。
　　 3.構(gòu)建了Vv-SPL9和Vv-SPL10 GFP表達(dá)載體,并進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果顯示兩者都僅在核內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光,即表明Vv-SPL9和Vv-SPL10均具有核定位功能。
　　 4.利用半定量和熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了Vv-SPL9、Vv-SPL10和Vv-miR156a在葡萄不同組織中的表達(dá),結(jié)果顯示這兩個(gè)基因在各個(gè)組織中均有表達(dá),但量存在