利用BSA-seq圖位克隆兩個(gè)水稻重要基因.pdf

1、水稻分蘗是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的重要特性，其分蘗數(shù)決定了有效穗數(shù)，進(jìn)而決定了水稻產(chǎn)量。穗是水稻的營(yíng)養(yǎng)器官，由若干小花和小穗組成。小花和小穗在不同水平上的發(fā)育決定了水稻穗部性狀和產(chǎn)量。因此分蘗和穗部發(fā)育是決定營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的兩個(gè)重要農(nóng)藝性狀。
　　本論文分離了在水稻秈稻品種明恢86組織培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)突變體srt1和 psh1-1/2，通過(guò)將 BSA和全基因組測(cè)序方法定位和克隆了這兩個(gè)基因，并對(duì)這兩個(gè)基因的功能進(jìn)行了初步分析。其結(jié)果如下

2、：
　　1. Sterile and Reduced Tillering1:表現(xiàn)單桿和雌性不育的突變體。
　　（1）srt1表現(xiàn)為很少或不分蘗。與對(duì)照明恢86（分蘗數(shù)為9.0±3.6）相比，突變體srt1的分蘗明顯少于對(duì)照，只有1-4個(gè)分蘗（0.5±0.7）。
　?。?）srt1的莖比野生型粗壯。從莖的橫切片結(jié)果來(lái)看，srt1的莖微管束發(fā)育比野生型多，能提供足夠的養(yǎng)分給整個(gè)植株；縱切結(jié)果顯示其細(xì)胞排列比野生型更有規(guī)律。

3、
　　（3）srt1的葉片顯得比野生型長(zhǎng)且寬。野生型與突變體 srt1葉片的長(zhǎng)寬比分別為：52.2±3.34:59.5±2.1和1.55±0.2:2.05±0.1。
　?。?）srt1表現(xiàn)為完全不育。花藥碘染實(shí)驗(yàn)顯示突變體的花藥表現(xiàn)正常。正反交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用 srt1作為父本，野生型作為母本結(jié)實(shí)率為9.9±6.8％，然而反過(guò)來(lái)srt1作為母本時(shí)顆粒無(wú)收，說(shuō)明srt1表現(xiàn)為雌性不育。
　?。?）通過(guò)BSA-seq方法比

4、較突變DNA池和野生DNA池間SNP頻率分布，計(jì)算 CAAFD值，發(fā)現(xiàn)在水稻4號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端約（29-34M）處 CAAFD有一個(gè)明顯的峰。在該期間開(kāi)發(fā) INDEL標(biāo)記，將目標(biāo)基因定位在231Kb范圍內(nèi)。
　?。?）在231kb區(qū)間內(nèi)共有37個(gè)ORFs。我們發(fā)現(xiàn)其中LOC_Os04g56780與野生型相比有21個(gè)堿基缺失。LOC_Os04g56780編碼水稻中與擬南芥 Wuschel(AtWUS）的同源基因OsWUS。
　

5、?。?）突變體中OsWUS的21bp發(fā)生在第一個(gè)外顯子上，使OsWUS的一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域 Homeobox中缺失了7個(gè)氨基酸。該缺失可能導(dǎo)致 OsWUS功能喪失，說(shuō)明Homeobox結(jié)構(gòu)域在OsWUS的功能上起重要作用。
　　2. Pepper-Shaped husk1：一個(gè)小花形狀異常的突變體。
　?。?）突變體 psh1-1表現(xiàn)為穗變短且密，其穗長(zhǎng)僅有野生型明恢86的20%。psh1-1的小花呈現(xiàn)辣椒狀，其外稃正常，外

6、稃明顯比野生型小。
　?。?）psh1-1的結(jié)實(shí)率僅有5.8%±7.2，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型的結(jié)實(shí)率（85.2%±4.9）。開(kāi)花時(shí)突變體的表型不正常，僅有一小部分突變體6.55%±5.3的花開(kāi)啟后能正常關(guān)閉，而野生型種大部分（84.65%±6.7）的花都能正常開(kāi)花及關(guān)閉。
　?。?）psh1-1的種子比野生型要小。突變體的粒長(zhǎng)（8.7±0.48）和粒寬（1.975±0.07）明顯小于野生型。psh1-1的粒形表現(xiàn)為辣椒狀，其千粒重

7、（28.67±0.65）明顯低于野生型（15.0±1.18）。
　?。?）通過(guò) F2群體的遺傳分析顯示，突變體 psh1-1表現(xiàn)為辣椒穎和低結(jié)實(shí)率的性狀受一對(duì)隱性等位基因控制。
　?。?）應(yīng)用 BSA-seq方法定位 PSH1，通過(guò)計(jì)算 CAAFD值發(fā)現(xiàn)在水稻4號(hào)染色體斷臂末端0-3Mb處有一個(gè)高峰。經(jīng)連鎖分析將該基因定位在218Kb的區(qū)間內(nèi)。
　?。?）該218Kb區(qū)間內(nèi)有31個(gè) ORFs。通過(guò)不同基因池中序列比對(duì)發(fā)

8、現(xiàn)，LOC_Os04g01590基因內(nèi)部的一個(gè)單堿基替換（G→ T）導(dǎo)致終止密碼TAA的產(chǎn)生，是蛋白質(zhì)提前終止。
　?。?）LOC_Os04g01590編碼精氨酸酶。它有6個(gè)外顯子，編碼340個(gè)氨基酸。突變體psh1-1中的第三個(gè)外顯子上的G到T的替換，及psh1-2中的第二個(gè)外顯子上的G到T的替換都能產(chǎn)生終止密碼TAG，使蛋白質(zhì)提前終止。這些結(jié)果顯示突變體表現(xiàn)出的突變性狀是由基因LOC_Os04g01590突變?cè)斐傻摹?br>