乳酸在腫瘤適應葡萄糖缺乏中的作用及其機制研究.pdf

1、腫瘤組織以快速增長為其基本特征，因此與正常組織相比，腫瘤組織需要大量的新生血管為它提供營養(yǎng)。但是腫瘤的新生血管往往結(jié)構(gòu)紊亂且功能不全，新生血管的生長速度也遠遠跟不上腫瘤生長的需要。因此，腫瘤組織離血管較遠的部分存在于低葡萄糖的環(huán)境中，據(jù)相關文獻報道，結(jié)腸癌和胃癌組織中心的葡萄糖濃度分別僅有0.12和0.4mM。但是處在缺乏葡萄糖環(huán)境中的腫瘤組織依然能夠生存。在體內(nèi)，腫瘤能夠調(diào)節(jié)自己適應葡萄糖缺乏的環(huán)境，但是在體外培養(yǎng)的環(huán)境中腫瘤細胞缺乏

2、葡萄糖供給時則無法生存。腫瘤在體內(nèi)是如何適應葡萄糖缺乏的環(huán)境，以等待血管新生獲得能量，這一問題的深入研究對于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機理顯得尤為重要。
　　Otto Warburg首先觀察到即使在氧氣充足的環(huán)境中，腫瘤仍然傾向于利用糖酵解途徑作為分解葡萄糖的主要方式。腫瘤這種特殊的代謝方式的轉(zhuǎn)換，就導致了糖酵解的產(chǎn)物乳酸的積聚。已有一些研究報道:在人宮頸癌、頭頸部腫瘤、直腸癌、非小細胞肺癌中乳酸水平升高與較高的轉(zhuǎn)移率和較差的臨床預后相關。

3、一些研究指出乳酸可以被腫瘤細胞利用，通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，從而為腫瘤細胞供能。乳酸也可以作為信號分子發(fā)揮作用，例如促進內(nèi)皮細胞分泌VEGF，它可以促進腫瘤細胞遷移和刺激血管生成。乳酸還可以抑制活化的T細胞，幫助腫瘤細胞完成免疫逃逸。
　　在實體腫瘤中，同時存在這樣的情況:一方面，血管的發(fā)育生長是遠遠跟不上腫瘤的快速生長，導致腫瘤組織內(nèi)存在葡萄糖缺乏區(qū)域;另一方面，在周邊血管豐富的區(qū)域，葡萄糖供給充足，腫瘤細胞通過有氧糖酵解產(chǎn)生

4、了大量的乳酸。這些乳酸分泌到細胞之間，對于缺少葡萄糖供給的腫瘤組織有重要病理生理作用。本研究將從體外培養(yǎng)中從細胞水平驗證乳酸對于腫瘤細胞應對葡萄糖缺乏的作用，并探討乳酸是如何調(diào)節(jié)腫瘤細胞適應葡萄糖缺乏，進一步從分子水平揭示乳酸調(diào)節(jié)的可能信號通路，并從動物模型中驗證我們的結(jié)果。本研究有助于揭示乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，為預測和治療腫瘤提供了新靶標。
　　第一部分乳酸維持腫瘤細胞在葡萄糖缺乏中生存
　　為了探究乳酸在腫瘤細胞抵抗

5、葡萄糖饑餓中的作用，我們首先在無糖完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)人肺腺癌細胞系A549細胞，并添加不同濃度的乳酸。發(fā)現(xiàn)添加乳酸能夠顯著延長A549細胞在無糖培養(yǎng)基的存活時間。其中在乳酸濃度為20mM的無糖培養(yǎng)環(huán)境中A549細胞的生存時間最長。對于其他四種腫瘤細胞系也具有同樣的效果，表明乳酸能夠幫助腫瘤細胞在葡萄糖缺乏的環(huán)境中生存。進一步我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性乳酸也具有同樣的作用，并且乳酸的作用需要氫離子與乳酸根離子共同參與。
　　接下來的實驗中為了證實

6、在無糖環(huán)境中乳酸是否是作為能量底物為腫瘤細胞提供能量，我們發(fā)現(xiàn)同樣濃度的丙酮酸并不能如乳酸一樣延長腫瘤細胞在無糖環(huán)境中的生存時間，而且采用Seahorse Bioscience XF24生物能量檢測儀檢測添加乳酸前后腫瘤細胞的氧氣消耗并沒有明顯的變化，在培養(yǎng)基中添加的乳酸在長時間的培養(yǎng)過程中也沒有出現(xiàn)明顯的消耗，采用干擾RNA技術下調(diào)乳酸進入細胞的主要轉(zhuǎn)運體MCT1和MCT4也沒有明顯影響乳酸的作用。在乳酸的調(diào)節(jié)下，無糖環(huán)境中A549細

7、胞的糖酵解、有氧糖代謝、磷酸戊糖途徑的關鍵酶基因表達均出現(xiàn)了降低。與乳酸相比，2-DG（糖酵解抑制劑）和魚藤酮（有氧呼吸抑制劑）在無糖環(huán)境中對腫瘤細胞生存時間的延長作用要小得多。因此，乳酸確實在無糖環(huán)境中降低了腫瘤細胞的糖代謝水平，但是其調(diào)節(jié)程度并不足以解釋乳酸長時間延長腫瘤細胞在無糖環(huán)境中生存的作用。
　　進一步，我們通過流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乳酸的參與下無糖環(huán)境中A549細胞的凋亡比例明顯下降，這種明顯的凋亡

8、減少使得腫瘤細胞在無糖環(huán)境下長期生存。
　　第二部分乳酸通過Bcl-2途徑抵抗腫瘤細胞因葡萄糖缺乏引起的凋亡
　　在第一部分的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)乳酸對不同腫瘤細胞株的作用有差異，對DU145、A549和H1299細胞株的增殖速度和生存時間明顯大于PC3和U87-MG細胞株，據(jù)此將腫瘤細胞株分乳酸敏度組和不敏感組。在比較了上述二組細胞株的遺傳學背景之后，我們通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與乳酸敏感組的細胞株相比，乳酸不敏感

9、組的PC3和U87-MG的AKT磷酸化增多。接著我們分別使用了AKT抑制劑哌立福新和激活劑胰島素樣生長因子1，證實乳酸可以活化AKT。
　　為進一步揭示乳酸活化AKT抗凋亡的具體信號傳過通路，我們對ATK的上下游分子分別作了篩查驗證。首先，通過使用PI3K抑制劑證實乳酸能夠通過PI3K顯著并迅速的引起AKT在蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點的磷酸化從而將其活化。然后，通過Western blot， RNA干擾技術和流式細胞儀檢測

10、技術，我們證實了乳酸可通過上調(diào)Bcl-2的蛋白表達抵抗腫瘤細胞在無糖環(huán)境中的細胞凋亡，并且證實Bcl-2上調(diào)與mTOR活化有關。最后，通過檢測線粒體釋放細胞色素C情況和Caspase9的活性，證實乳酸上調(diào)Bcl-2通過抑制細胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase9凋亡途徑從而抵抗腫瘤細胞的凋亡。至此，我們發(fā)現(xiàn)并證實了PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號通路在乳酸抵抗腫瘤細胞因葡萄糖缺乏引起凋亡過程的確切機制。
　　

11、第三部分乳酸在腫瘤適應葡萄糖缺乏中作用的體內(nèi)實驗研究
　　為驗證我們在體外發(fā)現(xiàn)的乳酸促腫瘤生存現(xiàn)象和PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號通路參與的抗凋亡機制，我們設計了乳酸作用荷瘤裸鼠動物實驗。建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型，在瘤周皮下注射乳酸和生理鹽水處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸促進裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長，減少荷瘤鼠的生存期，減少裸鼠A549肺癌皮下移植瘤壞死。
　　TUNEL和Caspase3/7檢測證實乳酸減少裸鼠A5

12、49肺癌皮下移植瘤凋亡。移植瘤的病理切片進行免疫組化染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸組與生理鹽水組相比，Phospho-AKT(Thr308), Phospho-AKT(Ser473), Bcl-2和Phospho-mTOR(Ser2448)的表達均增多，證實乳酸促進裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號通路活化。
　　結(jié)論
　　1.乳酸能夠維持腫瘤細胞在無糖環(huán)境中長時間生存，其功能與內(nèi)源性乳酸相似，是

13、由氫離子與乳酸根離子共同的效果。乳酸并不直接為腫瘤細胞提供能量，但降低了腫瘤細胞的糖代謝水平。在無糖環(huán)境中乳酸主要通過減少腫瘤細胞凋亡來維持其生存。
　　2.乳酸通過PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞減少因葡萄糖缺乏引起的細胞凋亡，乳酸通過上調(diào)Bcl-2抑制細胞色素C/凋亡蛋白酶活化因子-1/Caspase-9凋亡途徑。
　　3.乳酸促進裸鼠A549肺癌皮下移植瘤生長，減少荷瘤鼠的生存期，減少裸鼠A5

14、49肺癌皮下移植瘤壞死和凋亡。乳酸促進裸鼠A549肺癌皮下移植瘤內(nèi)PI3K/AKT/mTOR/Bcl-2信號通路活化。
　　創(chuàng)新點
　　1.發(fā)現(xiàn)并證實乳酸參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程，為預測和治療腫瘤提供了新靶標。
　　2.發(fā)現(xiàn)并證實在無糖環(huán)境中乳酸并不直接為腫瘤細胞提供能量，乳酸通過降低腫瘤細胞的糖代謝水平，減少腫瘤細胞凋亡來維持其生存。
　　3.初步揭示了乳酸促腫瘤生存作用的分子機制。乳酸通過PI3K/AKT/mTO