β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化葡萄糖制備低聚龍膽糖的研究.pdf

1、低聚龍膽糖是葡萄糖通過β-1，6-糖苷鍵組成的功能性低聚糖，是高效的雙歧桿菌增殖因子，有眾多優(yōu)良的生理功能，市場前景廣闊。低聚龍膽糖的研究和應(yīng)用起步晚，但發(fā)展很快。工業(yè)化生產(chǎn)低聚龍膽糖主要是通過酶法生產(chǎn)，但目前國內(nèi)仍未能大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
　　 本論文系統(tǒng)地研究了低聚龍膽糖的酶法生產(chǎn)工藝，以高濃度的葡萄糖為原料，利用高活性重組β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)糖苷和縮合得到低聚龍膽糖漿，再進(jìn)行分離純化獲得高純度的低聚龍膽糖成品。主要研究內(nèi)容如下:

2、
　　 1.將黑曲霉(Aspergillus niger CMI CC324262)β-葡萄糖苷酶的基因bgl連接到載體pPIC9K上，在畢赤酵母(Pichia pastoris)KM71中表達(dá)，成功構(gòu)建了基因工程菌KM71/bg//pPIC9K，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)HPLC、MS鑒定具有轉(zhuǎn)苷活性，可作為低聚龍膽糖的生產(chǎn)用酶。
　　 2.考察基因工程菌KM71/bg//pPIC9K的搖瓶發(fā)酵情況，確定適宜的發(fā)酵條件:生長階段接種量

3、10%，甘油初始濃度30 g/L，生長pH6.0，溫度30℃。誘導(dǎo)階段甲醇初始濃度4%，每24 h添加0.5%甲醇，誘導(dǎo)表達(dá)周期120h，誘導(dǎo)pH7.5，溫度30℃，250 mL三角瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)基裝液量50 mL，酶活可達(dá)到245 U/mL。本研究為低聚龍膽糖大規(guī)模生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 3.基因工程菌KM71/bg//pPIC9K發(fā)酵獲得β-葡萄糖苷酶粗酶液后，用于轉(zhuǎn)化葡萄糖制備低聚龍膽糖，優(yōu)化其反應(yīng)條件。確定最佳條件:底

4、物濃度為80%，反應(yīng)pH4.5，溫度60℃，每克葡萄糖加酶60 U，添加1mmol/L的K+，轉(zhuǎn)化周期為48 h，低聚龍膽糖濃度為50 g/L。
　　 4.初步研究酶反應(yīng)產(chǎn)物中低聚龍膽糖的分離純化。比較結(jié)晶、色譜柱兩種分離方法，結(jié)果表明色譜柱分離法效果較好，最佳分離條件是利用陽離子樹脂DTF-02，控制分離柱柱高500 mm，內(nèi)徑16 mm，分離溫度50℃，進(jìn)料量0.25 g低聚龍膽糖，以水為洗脫劑，2 mL/min的洗脫流速，