microRNA-195在肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　葡萄糖攝取是機(jī)體內(nèi)新陳代謝中極其重要的一個(gè)生物進(jìn)程且調(diào)控著人類(lèi)機(jī)體內(nèi)的多個(gè)信號(hào)通路及蛋白表達(dá)，葡萄糖攝取障礙會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗以及其他代謝的異常，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病以及癌癥等威脅人類(lèi)健康的各種疾病。棕櫚酸（PA）做為飽和脂肪酸的一種已經(jīng)被證明了可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞形成葡萄糖攝取障礙，建立胰島素抵抗模型。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類(lèi)非編碼的小分子單鏈RNA，通過(guò)與其目標(biāo)mRNA分子的3'端(3'UTR)互

2、補(bǔ)匹配導(dǎo)致該mRNA分子的翻譯受到抑制，而后在分子水平上調(diào)控各種信號(hào)通路。有大量研究結(jié)果顯示miRNAs可以調(diào)控葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡。miR-195也已經(jīng)被證明，可以調(diào)控多種信號(hào)通路及蛋白的表達(dá)且與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展有著密切關(guān)聯(lián)，但其對(duì)葡萄糖攝取進(jìn)程的影響及具體分子機(jī)制尚不明確。
　　研究目的：
　　1．明確miR-195在棕櫚酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙中是否表達(dá)異常；
　　2．驗(yàn)證miR-195是否調(diào)控肝細(xì)胞L02

3、的葡萄糖攝取障礙進(jìn)程；
　　3．miR-195靶基因的篩選及驗(yàn)證；
　　4．探究miR-195在肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙中的具體機(jī)制。
　　第一部分 PA處理肝細(xì)胞L02后microRNA-195表達(dá)變化情況
　　以不同濃度棕櫚酸PA（0.6 mmol/L，1 mmol/L）分別誘導(dǎo)肝細(xì)胞L028h，于倒置顯微鏡下觀察處理后的肝細(xì)胞L02的形態(tài)，然后運(yùn)用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)各個(gè)組中肝細(xì)胞L02的葡萄糖

4、攝取能力，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-195的表達(dá)變化情況。
　　研究方法：
　　1．倒置顯微鏡下觀察棕櫚酸處理肝細(xì)胞L02后的形態(tài)變化；
　　2．葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)不同濃度棕櫚酸處理肝細(xì)胞 L02后葡萄糖攝取能力；
　　3．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)葡萄糖攝取障礙后miR-195表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1．顯微鏡下初步觀察到棕櫚酸（PA）處理的肝細(xì)胞L02的細(xì)胞形態(tài)明顯模糊化，邊緣不清晰無(wú)

5、明顯棱角且呈橢圓狀，細(xì)胞與細(xì)胞間隔松散無(wú)清晰界限，細(xì)胞核增大；
　　2．葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)（0.6 mmol/L和1 mmol/L）濃度的PA處理肝細(xì)胞 L02后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的葡萄糖濃度比對(duì)照組高，說(shuō)明肝細(xì)胞L02在一定濃度棕櫚酸的誘導(dǎo)下葡萄糖攝取能力降低，且隨著PA濃度的提高，其葡萄糖攝取能力有越來(lái)越低的趨勢(shì)；
　　3．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙后miR-195表達(dá)升高。<

6、br>　　結(jié)論：
　　0.6 mmol/L，1 mmol/L的PA誘導(dǎo)肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙，且肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取障礙后miR-195高表達(dá)。
　　第二部分 microRNA-195對(duì)肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取的影響
　　葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)高表達(dá)及低表達(dá)miR-195后其葡萄糖攝取能力的變化以及棕櫚酸處理高表達(dá)及低表達(dá)miR-195后的肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力的變化。Western-blot法驗(yàn)證G

7、LUT1和GLUT4在高表達(dá)及低表達(dá)miR-195后的表達(dá)變化。
　　研究方法：
　　1．激光共聚焦檢測(cè)肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的熒光強(qiáng)度，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；
　　2．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的miR-195的表達(dá)；
　　3．葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)miR-195高表達(dá)及低表達(dá)后

8、肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力的變化；葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法檢測(cè)棕櫚酸處理miR-195高表達(dá)及低表達(dá)后的肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力的變化；
　　4．Western-blot法檢測(cè)miR-195高表達(dá)或低表達(dá)后GLUT1和GLUT4的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1．激光共聚焦檢測(cè)肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染miR-195 mimic以及miR-195 inhibitor后的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40％；
　　2．實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果

9、證實(shí)了肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)染miR-195 mimic后miR-195的表達(dá)升高，轉(zhuǎn)染miR-195 inhibitor后miR-195的表達(dá)降低；
　　3．葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法結(jié)果證實(shí)了過(guò)表達(dá)miR-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖的攝取能力較Control降低，低表達(dá)miR-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力較Control組有所提高。葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶法的結(jié)果證實(shí)了PA誘導(dǎo)與miR-195高表達(dá)同時(shí)干預(yù)有增強(qiáng)葡萄糖攝取障礙的

10、趨勢(shì)；
　　4．Western-blot的結(jié)果證明了高表達(dá)miR-195下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　過(guò)表達(dá) miR-195后肝細(xì)胞L02的葡萄糖攝取能力較對(duì)照組降低，而低表達(dá)miR-195后肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取能力較對(duì)照組有所提高；櫚酸處理與miR-195高表達(dá)同時(shí)作用于肝細(xì)胞L02可加強(qiáng)其葡萄糖攝取障礙；過(guò)表達(dá)miR-195可下調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體GLUT1的表達(dá)。
　　第三部分 micro

11、RNA-195靶基因Sirt-1的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證
　　基于多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè) miR-195的靶基因以及 Western-blot法驗(yàn)證其是否為miR-195的靶基因，并探究其靶基因與葡萄糖代謝相關(guān)蛋白之間的作用機(jī)制。
　　研究方法：
　　1．基于多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)miR-195的靶基因；
　　2．Western-blot檢測(cè)miR-195高表達(dá)及低表達(dá)后候選靶基因Sirt-1的表達(dá)變化；
　　3．Wester

12、n-blot檢測(cè)Sirt-1表達(dá)被干涉后GLUT1和GLUT4的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1．多種數(shù)據(jù)庫(kù)分析預(yù)測(cè)miR-195的靶基因可能性較大的為Sirt-1；
　　2．Western-blot檢測(cè)miR-195高表達(dá)后Sirt-1表達(dá)降低，低表達(dá)后Sirt-1表達(dá)升高；
　　3．Western-blot檢測(cè)Sirt-1表達(dá)被干涉后GLUT1和GLUT4表達(dá)均降低。
　　結(jié)論：
　　miR-1