SIRT1抑制氧化低密度脂蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的：氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL)與動(dòng)脈粥樣硬化形成密切相關(guān)。自噬在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中有降解ox-LDL的作用。Sirtuin1(SIRT1)，一種新型抗動(dòng)脈粥樣硬化因子，是哺乳動(dòng)物沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子2的同源物，對(duì)細(xì)胞的生存、代謝等生理活動(dòng)起著十分重要的調(diào)節(jié)作用，可能

2、是所有生物共同的壽命控制基因之一，并且有誘導(dǎo)自噬作用。本文研究SIRT1對(duì)HUVECs內(nèi)ox-LDL聚集的影響，并初步探討其作用是否與其促進(jìn)ox-LDL自噬性降解有關(guān)。
　　方法：
　　1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)SIRT1抑制劑尼克酰胺(nicotinamide, NAM)和激動(dòng)劑白藜蘆醇(resveratrol, RSV)對(duì)Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影響；利用SIRT1小干擾RNA(small interfering

3、 RNA, siRNA)轉(zhuǎn)染構(gòu)建SIRT1 siRNA內(nèi)皮細(xì)胞模型，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影響。
　　2.利用自噬相關(guān)基因Atg5小干擾RNA轉(zhuǎn)染構(gòu)建Atg5 siRNA內(nèi)皮細(xì)胞模型，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)白藜蘆醇抑制Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影響；采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)自噬流相關(guān)蛋白LC3、p62的蛋白含量，并用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察各組LC3熒光點(diǎn)的數(shù)目

4、；通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察HUVECs中Dil-ox-LDL與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)amp1和Cathepsin D的共定位情況。
　　結(jié)果：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示SIRT1 siRNA和NAM增加HUVECs中Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度，RSV減少HUVECs中Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度。
　　2.敲減Atg5增加HUVECs中Dil-ox-LDL的熒光強(qiáng)度；與RSV組相比，Atg5 siRNA和RSV組的HU

5、VECs中Dil-ox-LDL熒光強(qiáng)度增加。
　　3.免疫印跡結(jié)果顯示ox-LDL升高LC3-II和p62的蛋白表達(dá)，與單獨(dú)ox-LDL組相比，SIRT1 siRNA+ox-LDL組和NAM+ox-LDL組LC3-II的蛋白表達(dá)降低，p62蛋白水平升高，RSV+ox-LDL組LC3-II的蛋白表達(dá)升高，p62蛋白水平降低。運(yùn)用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)SIRT1 siRNA和NAM減少LC3點(diǎn)狀物數(shù)目，RSV

6、增加LC3點(diǎn)狀物數(shù)目。
　　4.免疫熒光結(jié)果顯示Dil-ox-LDL與Lamp1及Cathepsin D部分共定位，與Dil-ox-LDL單獨(dú)組相比，SIRT1 siRNA和NAM減少Dil-ox-LDL和Lamp1及Cathepsin D共定位程度，RSV增加Dil-ox-LDL和Lamp1及Cathepsin D共定位程度。
　　結(jié)論：SIRT1抑制劑及敲減SIRT1基因增加ox-LDL在HUVECs中的聚集，SIRT1