自噬抑制氧化低密度脂蛋白在人血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集的作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　 觀察自噬對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中聚集的影響。
　　 方法：
　　 1．運(yùn)用不同時(shí)間點(diǎn)的Dil-ox-LDL處理HUVECs，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HUVECs中Dil-ox-LDL的含量。
　　 2．在自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和抑制劑3甲基腺嘌呤(3MA)干預(yù)下，觀察自噬對(duì)Dil-ox-LDL在HUVECs中聚集的影響。
　　 3．在雷帕霉素和3

2、MA干預(yù)下，通過(guò)免疫熒光技術(shù)觀察HUVECs中Dil-ox-LDL與自噬標(biāo)記物L(fēng)C3以及溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP1的共定位情況，以及HUVECs中LC3與LAMP1的共定位情況，初步探討自噬抑制HUVECs中ox-LDL聚集的可能機(jī)制；采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)自噬流相關(guān)蛋白LC3、beclin1、LAMP1、P62的蛋白含量，進(jìn)一步證實(shí)自噬參與了ox-LDL在HUVECs中的降解。
　　 結(jié)果：
　　 1．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

3、顯示Dil-ox-LDL在HUVECs中的積聚量隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)而增加,3h細(xì)胞內(nèi)Dil-ox-LDL是0小時(shí)的8.53倍,3h時(shí)間點(diǎn)下雷帕霉素可抑制HUVECs中ox-LDL的積聚（P=0.003）而3MA能夠增加HUVECs中ox-LDL的積聚(P=0.035)。
　　 2．免疫熒光技術(shù)顯示3h時(shí)間點(diǎn)下，Dil-ox-LDL與LC3及LAMP1發(fā)生大量共定位，此時(shí)LC3與LAMP1也大量共定位，同時(shí)Dil-ox-LDL與LC3

4、及LAMP1、LC3與LAMP1的共定位能夠被雷帕霉素增加，被3MA所抑制。
　　 3．免疫印跡技術(shù)結(jié)果顯示，ox-LDL作用于HUVECs3h后，LC3-Ⅱ/LC3-I（P=0.024）、beclin1(P=0.005)及LAMP1(P＜0.001)蛋白表達(dá)明顯增加，P62蛋白水平降低(P＜0.001)；與ox-LDL組相比雷帕霉素能夠進(jìn)一步增加LC3-Ⅱ/LC3-I（P=0.045）和beclin1(P=0.001)蛋白表達(dá)

5、，降低P62(P=0.030)蛋白表達(dá)；與ox-LDL組相比3MA能夠降低LC3-Ⅱ/LC3-I(P＜O.O01)和beclin1(P＜0.001)蛋白表達(dá)，增加P62(P＜0.001)蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 ox-LDL在HUVECs中聚集隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，雷帕霉素作用后可抑制ox-LDL在HUVECs中聚集，雷帕霉素上調(diào)ox-LDL作用后HUVECs中自噬流水平，增高的自噬流促進(jìn)自噬泡對(duì)ox-LDL吞