腫瘤壞死因子-α對(duì)低密度脂蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是許多心、腦血管病的共同發(fā)病學(xué)基礎(chǔ)，是引起老年人死亡的最主要原因之一。近年調(diào)查表明，動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率還在升高，發(fā)病的年齡有繼續(xù)年輕化的趨勢(shì)，成為威脅人類健康的一個(gè)重大問(wèn)題。
　　 在病理學(xué)上，AS主要表現(xiàn)為低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL），特別是氧化修飾的低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，O

2、x-LDL）在動(dòng)脈血管內(nèi)膜下的沉積，繼而引起泡沫細(xì)胞形成、炎癥反應(yīng)等一系列改變，最后導(dǎo)致粥樣斑塊的形成。AS發(fā)病機(jī)制雖遠(yuǎn)未完全闡明，但血管內(nèi)皮的損傷與高脂血癥的作用最為受到關(guān)注。動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及功能的改變一度被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)因素。
　　 基于此，本論文首先研究了低密度脂蛋白以及氧化修飾的低密度脂蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)無(wú)論是低密度脂蛋白，還是氧化修飾的低密度脂蛋白，在低濃度是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的，

3、只有在遠(yuǎn)超出正常濃度的較高水平才能引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　 考慮到引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷的低密度脂蛋白以及氧化修飾的低密度脂蛋白的濃度較高，即使在高脂血癥的病人中也不常見(jiàn)，且許多發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的患者血漿脂蛋白水平并不高，本課題組設(shè)想，也許動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)并不是內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，而僅僅是內(nèi)皮細(xì)胞通透功能的增加，而這種通透不是內(nèi)皮細(xì)胞之間間隙的通透性的增加，而是內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞（transcytosis）的增加，使得更多的脂蛋白

4、越過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞，沉積于血管內(nèi)膜下，觸發(fā)AS的發(fā)生。鑒于此，本研究建立了體外脂蛋白穿胞模型，首先證實(shí)了LDL在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的發(fā)生，且此穿胞過(guò)程與細(xì)胞膜脂筏（lipid raft，LR）及神經(jīng)酰胺(ceramide)密切相關(guān)，脂筏干擾劑（M-β-CD）及脂筏中鞘磷脂水解生成神經(jīng)酰胺的酶抑制劑（Desipramine）可有效阻止脂蛋白的穿胞。同時(shí)，考慮到炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中扮演十分重要的角色，本研究進(jìn)一步研究了炎癥介質(zhì)腫瘤

5、壞死因子（TNF-α）對(duì)LDL在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的影響，發(fā)現(xiàn)TNF-α可增加脂蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞之后，進(jìn)一步從脂蛋白受體（LDL-R）及穿胞相關(guān)蛋白caveolin-1，clathrin等表達(dá)的變化的角度對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了初步的探討，發(fā)現(xiàn)TNF-α增強(qiáng)脂蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的過(guò)程，可能與其增加上述脂蛋白受體及穿胞相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些研究可望為開(kāi)發(fā)防治動(dòng)脈粥樣硬化的新藥提供全新的思路和靶點(diǎn)。
　　 第一部分:LDL、

6、Ox-LDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）活力的影響及甲基-β-環(huán)糊精、地昔帕明的作用
　　 目的：觀察LDL、Ox-LDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響以及甲基-β-環(huán)糊精、地昔帕明對(duì)其影響的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 材料和方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8），測(cè)定不同處理組的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果：1、當(dāng)LDL濃度＜300μg/ml時(shí)，隨著

7、LDL濃度的增加，LDL可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，當(dāng)LDL濃度＞500μg /ml時(shí)，對(duì)HUVECs有明顯損傷作用；當(dāng)Ox-LDL的濃度＜100μg/ml時(shí)，隨著Ox-LDL濃度的增加，Ox-LDL可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，當(dāng)Ox-LDL濃度＞300μg /ml時(shí)，對(duì)HUVECs有明顯損傷作用； 2、一定濃度的M-β-CD（5mmol/L）、Desipramine（30μmol/L）可以有效的阻止或逆轉(zhuǎn)高濃度的LDL（500μg /ml）、Ox-L

8、DL（300μg /ml）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷效應(yīng)。
　　 結(jié)論：低濃度時(shí)，LDL和Ox-LDL可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)；高濃度時(shí)，LDL和Ox-LDL會(huì)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，脂筏干擾劑M-β-CD、Desipramine對(duì)這種損傷均具有逆轉(zhuǎn)作用。
　　 第二部分：LDL穿胞模型的建立以及TNF-α對(duì)LDL穿胞過(guò)程的影響及機(jī)制
　　 目的：探討TNF-α對(duì)于LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的影響及其機(jī)制的研究。

9、r>　　 材料和方法：1、對(duì)LDL進(jìn)行體外標(biāo)記上熒光素FITC，成FITC-LDL；2、利用細(xì)胞培養(yǎng)小池建立穿胞模型，模仿血管內(nèi)面的內(nèi)皮細(xì)胞單層，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)小池外FITC熒光強(qiáng)度的變化來(lái)反映LDL穿胞的變化；在此模型基礎(chǔ)上，研究了脂筏干擾劑(M-β-CD、Desipramine)對(duì)LDL在內(nèi)皮中穿透過(guò)程的影響；3、利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（Cell counting kit-8，CCK-8），測(cè)定TNF-α對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，并

10、在建立的穿胞模型中研究了TNF-α對(duì)LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞過(guò)程的影響。4、Western blot方法檢測(cè)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、clathrin、LDLR蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、在體外建立的穿胞模型中，LDL可以發(fā)生穿胞；2、脂筏干擾劑(M-β-CD、Desipramine)可以減少LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞。3、TNF-α在0.1到100ng/ml的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，對(duì)細(xì)胞活性

11、有促進(jìn)的作用；而當(dāng)?shù)竭_(dá)1000ng/ml的高濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用反而減弱。用30ng/ml TNF-α處理細(xì)胞的1到4天中，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞的活性也會(huì)增加。4、炎癥因子TNF-α可以促進(jìn)LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞。5、在TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的一到四天中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，caveolin-1、LDLR蛋白的表達(dá)增加；而Clathrin的表達(dá)在一到三天內(nèi)會(huì)增加，第四天卻出現(xiàn)下降。在TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的

12、30min到24h中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，caveolin-1、clathrin、LDLR的表達(dá)均有不同程度的增加。
　　 結(jié)論：1、LDL可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的穿胞作用而沉積于內(nèi)膜下。2、LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中穿胞的過(guò)程與脂筏的作用有關(guān)。3、TNF-α可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且這種促進(jìn)作用有濃度和時(shí)間依賴性；4、TNF-α可以促進(jìn)LDL在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的穿胞，并且這種促進(jìn)穿胞的作用與脂蛋白受體及脂筏及相關(guān)蛋白caveo