DNA電化學生物傳感器中的新方法學研究.pdf

1、隨著疾病診斷、基因測試、法醫(yī)鑒證、生化戰(zhàn)爭預防、環(huán)境監(jiān)測等領域的發(fā)展，對特定DNA序列進行準確、簡單、快速的檢測越顯重要。DNA生物傳感器主要是利用堿基互補原理對目標DNA進行檢測，當已知序列DNA探針與被檢的DNA序列發(fā)生雜交反應，來辨明DNA的存在與否。其中，電化學DNA生物傳感器利用雜交原理及電化學標記物為雜交檢測信號，具有操作簡便快速、信號靈敏，能與DNA生物芯片兼容等優(yōu)點，具有非常重要的研究價值。目前電化學DNA檢測方法以其輕

2、巧便宜、高靈敏度、方便攜帶、能耗少、易于實現(xiàn)微型化等優(yōu)點，受到了廣泛的關注，成為當今生物學、醫(yī)學領域的前沿性課題。納米技術(shù)的出現(xiàn)為各個科學領域提供新的發(fā)展前景。納米微粒具有的特點有：大比表面積、高活性、高特異物性、極微小性等，與傳感器所要求的多功能、微型化相互匹配。作為理想的傳感器材料，需要有著高靈敏度、多樣功能性、響應高，速度快、檢測范圍寬、選擇性高、穩(wěn)定性好。納米微粒能很好地滿足上述要求。以納米材料為原料的化學傳感器能夠應用于生產(chǎn)、

3、生活、環(huán)境監(jiān)測等各個領域；目前單分子水平的探針制備技術(shù)、納米集成陣列電極、修飾電極等方面的研究取得巨大的進展。超分子化學是分子之間通過非共價鍵相互作用而形成的分子聚集體的化學學科，隨著與醫(yī)藥科學、生命生物科學、信息科學、納米材料科學的交叉融合中，超分子化學已發(fā)展為應用范圍廣泛的超分子科學。被認為是21世紀新思路和高科技的重要基礎學科之一。環(huán)糊精作為典型的超分子識別個體中的重要主體化合物以其獨特的識別性質(zhì)受到廣泛的關注。對它的研究從主客體

4、識別形成包合物的機理已經(jīng)轉(zhuǎn)移到對其在分析化學、醫(yī)藥制備、環(huán)境檢測和生物傳感器等領域的應用研究。本文的主要創(chuàng)新之處就是將納米技術(shù)及超分子包合作用相互融合構(gòu)建了不需要固定探針的新型DNA電化學生物傳感器。同時基于生物分子之間的替代作用等與電化學分析技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了用于檢測DNA及凝血酶蛋白的電化學傳感器。這兩種傳感器具有高特異性，及構(gòu)建簡單，能夠成功地應用于對特定序列DNA片斷的選擇性測定和對目標蛋白的準確識別，為基因及蛋白質(zhì)分析測定提供了

5、一種簡便、便捷、廉價的新理念。本研究分為六個部分：
　　 第一章緒論。介紹了DNA電化學生物傳感器的研究進展。著重介紹了DNA生物傳感器的原理（包括DNA探針及其分子識別原理和探針DNA在固體基質(zhì)表面的固定化）和DNA生物傳感器中不同的雜交電化學標示劑，敘述了DNA電化學傳感器在基因檢測等方面的應用。接著介紹了核酸適配體生物傳感器和碳納米管在生物傳感器中的一系列應用。最后闡述了本論文的目的和意義，指出論文的創(chuàng)新之處及主要研究內(nèi)容

6、。
　　 第二章基于蛋白與其核酸適配體的替代機理構(gòu)建的凝血酶電化學生物傳感器的研究?；谀繕说鞍着c其核酸適配體替代機制構(gòu)建的設計了一種電化學適體傳感器。該傳感器預先將含有巰基的單鏈固定DNA(IP)與目標凝血酶(thrombin)核酸適配體(aptamer)通過雜交反應得到雙鏈DNA(dsDNA)，通過Au-S鍵自組裝于金電極表面，而另一標記有CdS納米顆粒的單鏈DNA(DP-CdS)被用作檢測探針。當預先制備好的雙鏈DNA修飾

7、金電極浸入含有凝血酶與DP-CdS的共存的溶液時，dsDNA中的aptamer更傾向與目標thrombin結(jié)合形成G-四分體，從而引起dsDNA離解，IP從而能夠與DP-CdS堿基互補。將電極捕獲的CdS納米顆粒溶解，使用汞膜電極對溶出的Cd2+離子進行電化學檢測，獲得靈敏的電化學信號傳遞。Cd2+離子的峰電流相對thrombin濃度在2.3×10-9-2.3×10-12mol/L范圍內(nèi)有良好的線性響應，檢出限為4.3×10-13mol

8、/L。檢測具有良好的特異性，BSA，溶菌酶等其他蛋白質(zhì)共存不會影響thrombin的檢測。
　　 第三章基于DNA競爭替代機理的電化學開關生物傳感器的研究。設計了一種基于DNA之間雜交競爭替代機制的電化學DNA傳感器。該傳感器通過預先將3’修飾了巰基，5’修飾了二茂鐵的發(fā)夾探針DNA與識別DNA雜交形成雙鏈DNA，然后通過金硫鍵將其組裝于金電極表面。此時二茂鐵位于雙鏈DNA的頂端，遠離電極表面，呈現(xiàn)出“Switch-off”狀態(tài)

9、，僅僅產(chǎn)生一個小的背景信號。目標DNA加入后，由于與識別DNA之間具有更多互補堿基，在雜交的競爭作用下，識別DNA離開探針DNA，與目標結(jié)合，探針DNA隨之恢復原有的發(fā)夾狀態(tài)，二茂鐵靠近電極表面，呈現(xiàn)出“Switch-on”狀態(tài)，同時獲得一個較大的電化學信號。通過目標加入前后電化學信號變化，可實現(xiàn)對目標的檢測。本文將適體技術(shù)、電化學分子信標技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)了對目標DNA和蛋白質(zhì)的靈敏、高效、方便的檢測。此電化學競爭開關生物傳感器有望在生

10、物檢測領域有更廣泛的應用。
　　 第四章基于β-環(huán)糊精主客體識別和CdS納米顆粒構(gòu)建的電化學生物傳感器?；谥骺腕w分子識別技術(shù)設計了一種不需要固定探針DNA的電化學檢測DNA的新方法。這種傳感技術(shù)采用了一種新穎的以莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在的雙標記DNA探針(DLP)，該探針的一端標記了4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)作為客體分子，另一端連接了CdS納米顆粒作為電化學指示劑指示雜交反應的發(fā)生。同時使用環(huán)糊精修飾的電極捕獲DL

11、P上標記的dabcyl。雜交反應發(fā)生前，探針保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，迫使dabcyl分子靠近CdS納米顆粒。由于空間立體效應，阻礙了dabcyl與電極表面β-CD的結(jié)合，導致DLP不能被電極捕獲。與目標DNA雜交后，DLP的莖環(huán)結(jié)構(gòu)展開，使得dabcyl分子易于進入修飾電極表面的β-CD空腔中，進而DLP信號可以被β-CD修飾電極捕獲。并且，捕獲效應與目標DNA濃度成正比。
　　 第五章基于主客體識別作用構(gòu)建的非固定的DNA電化學生物傳感

12、器的研究?；谥骺腕w分子識別技術(shù)構(gòu)建了電化學檢測DNA的新方法。這種傳感技術(shù)采用了一種新穎的以莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式存在的雙標記DNA探針(DLP)，該探針的一端標記了4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)作為客體分子，另一端標記了金膠作為電化學指示劑指示雜交反應的發(fā)生。同時采用α-CD/MCNTs/GCE電極捕獲雜交反應轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的電化學信號。雜交反應發(fā)生前，雙標記DNA探針保持莖環(huán)結(jié)構(gòu)，迫使dabcyl分子靠近金膠。由于金膠的空間立體效

13、應，阻礙了dabcyl與電極表面α-CD的結(jié)合，導致DLP不能被電極捕獲。與目標DNA雜交后，DLP的莖環(huán)結(jié)構(gòu)展開，使得dabcyl分子易于進入修飾電極表面的α-CD空腔中，進而DLP信號可以被α-CD修飾電極捕獲。并且，捕獲效應與目標DNA濃度成正比。因此，與目標的雜交過程可靈敏地轉(zhuǎn)換并檢測DLP標記的金膠AuCl4-的電化學還原電流信號。采用這種新方法，檢測目標DNA的濃度可低至2.6×10-10M甚至對單堿基錯配也有很好的區(qū)分能力

14、。
　　 第六章基于環(huán)糊精修飾的納米顆粒構(gòu)建的電化學生物傳感器的研究。構(gòu)建了一種基于環(huán)糊精修飾的納米顆粒的電化學DNA傳感器，將DNA雜交引起的探針DNA構(gòu)型變化通過主客體識別技術(shù)與納米顆粒標記結(jié)合，并轉(zhuǎn)換為電化學信號。該傳感器中，末端標記有4-4-二甲氨基苯基偶氮苯甲酸(dabcyl)和巰基基團的發(fā)夾DNA作為探針DNA通過金硫鍵組裝于金電極表面，而表面修飾有β-環(huán)糊精的CdS納米顆粒(CdS-CDs)則被用于電化學信號提供者