DNA電化學生物傳感器的構(gòu)建及其生化分析新方法研究.pdf

1、隨著精準醫(yī)療、基因測試、法醫(yī)鑒定、環(huán)境檢測等研究領(lǐng)域的迅速發(fā)展，實現(xiàn)對病原蛋白和特定序列DNA的快速、靈敏、簡單的痕量分析越來越重要?；贒NA的電化學生物傳感器由于輕巧便宜、能耗少、靈敏度高和易于微型化等優(yōu)勢引起了廣泛的關(guān)注，成為當今生化分析、轉(zhuǎn)化醫(yī)學等交叉領(lǐng)域的前沿性課題。核酸分子體外等溫擴增技術(shù)是分子生物學領(lǐng)域常用的一種研究方法。DNA電化學生物傳感器利用電化學檢測的高靈敏性，與各種可再生策略和信號放大策略相結(jié)合，可以實現(xiàn)對痕量靶

2、標的靈敏檢測。本文圍繞DNA電化學生物傳感器研究的關(guān)鍵問題，即如何快速制備穩(wěn)定、高活性的傳感界面，如何構(gòu)建信號重現(xiàn)、可再生的新型器件、如何進行信號放大實現(xiàn)對靶標高靈敏的檢測等問題，制備了一系列新型DNA電化學生物傳感器，并將其應(yīng)用于生化分析中。以DNA探針為平臺，結(jié)合DNA鏈置換反應(yīng)、生物酶催化、聚鳥嘌呤納米線等技術(shù)，在發(fā)展DNA電化學生物傳感檢測方面做了以下工作:
　　1.基于低pH和高鹽濃度緩沖用于金固相界面快速組裝單鏈DNA

3、探針
　　實現(xiàn)單鏈DNA（ssDNA）探針在傳感界面上的快速、穩(wěn)定、簡單的組裝，可以有力推動DNA電化學傳感器臨床檢測、現(xiàn)場診斷等方面的實際應(yīng)用。本章中，利用低pH高鹽濃度方法實現(xiàn)了ssDNA在金電極表面的快速固定化，探針組裝過程可以在30分鐘之內(nèi)完成，且不會影響DNA探針的雜交活性。更深入的探討了固定機理，通過電化學阻抗圖譜計算出ssDNA探針在電極表面的覆蓋度和反應(yīng)的吉布斯自由能，說明低pH高鹽濃度方法是通過化學吸附，即共價鍵

4、結(jié)合的方式將ssDNA固定在金電極表面。pH和鹽濃度均會影響固定化進程，兩者存在協(xié)同作用。這種方法相比于傳統(tǒng)方法（生理pH緩沖）操作更加簡便、快速，對不同長度DNA片段均可以作用，具有較好的普適性。因此，該方法適用于構(gòu)建各種基于DNA的電化學傳感器，在快速制備DNA傳感芯片等領(lǐng)域有較強的潛在應(yīng)用價值。
　　2.基于DNA鏈置換反應(yīng)和鎖核酸技術(shù)構(gòu)建可再生DNA電化學傳感器用于檢測單核苷酸多態(tài)性
　　近年來，單核苷酸多態(tài)性（SN

5、P）的靈敏檢測一直是基因診斷研究中的重要課題。本章報道了一種基于鎖核酸修飾技術(shù)和DNA鏈置換反應(yīng)構(gòu)建的可再生電化學傳感器，并將其用于 p53基因273位點單堿基突變的靈敏檢測。此類傳感器件可以通過監(jiān)測電流信號ON和OFF的狀態(tài)判斷目標物存在與否。當電流信號由ON轉(zhuǎn)變?yōu)镺FF時，電極表面由于目標物的存在發(fā)生了DNA鏈置換反應(yīng)。當有其他干擾序列存在時，電流信號不變，體系依舊保持ON的狀態(tài)。把LNA和SDR技術(shù)引入到檢測體系中，提高了鏈置換反

6、應(yīng)的速率和傳感器檢測的效果。此外，本章構(gòu)建的傳感器具有優(yōu)異的選擇性和穩(wěn)定性，在污染緩沖和高倍數(shù)魚精基因組中仍然可以實現(xiàn)對目標基因的檢測。同時，實驗過程中無生物酶的參與，不需要復雜的儀器操作和精密的溫度控制。因此，這個新設(shè)計的DNA電化學傳感器對于目標DNA分子的檢測不僅具有較好的靈敏度，而且具有優(yōu)異的選擇性和可再生性，在未來的生物芯片設(shè)計中具有良好的應(yīng)用前景。
　　3.基于i-motif構(gòu)象轉(zhuǎn)換構(gòu)建可再生DNA電化學傳感器用于檢測

7、葡萄糖和尿素
　　以i-motif結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)開展了廣泛研究，如拓撲性質(zhì)、pH傳感、納米機器等。然而，利用i-motif結(jié)構(gòu)作為傳感器元件，探討在生物檢測方向的應(yīng)用少有報道。本章通過利用富含胞嘧啶的DNA探針在不同pH值下的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，發(fā)展了一種新型簡單且無標記的電化學方法，用于檢測葡萄糖和尿素。通過葡萄糖氧化酶和脲酶的生物催化反應(yīng)實現(xiàn)反應(yīng)溶液pH值的調(diào)節(jié)，進而調(diào)節(jié)富含胞嘧啶的DNA探針在單鏈構(gòu)象和i-motif構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變。通過電

8、化學阻抗的方法可以實現(xiàn)對構(gòu)象轉(zhuǎn)變的表征，利用電化學阻抗值的變化可以實現(xiàn)對目標物葡萄糖和尿素的檢測。由于酶催化的優(yōu)異特異性，使此傳感器具有較高的選擇性，其他生物分子干擾物不影響目標物的檢測。此外，此傳感器還具有較高的可再生性能和穩(wěn)定性，具有較強的潛在應(yīng)用價值。
　　4.基于聚鳥嘌呤納米線信號放大靈敏檢測核酸片段
　　近年來，許多信號放大測試策略已被報道用于構(gòu)建靈敏的電學、光學等傳感平臺，實現(xiàn)對核酸、蛋白等生物分子的檢測。但大多

9、數(shù)檢測方法具有貴重的溫控儀器、復雜的實驗步驟、耗時長等缺點。因此，開發(fā)簡便易行、快速靈敏的新型信號放大策略具有十分重要的意義。本章中利用富含G堿基的c-myc DNA序列，在鉀離子存在下形成具有TMB催化活性的G-四鏈體，繼續(xù)加入鎂離子后形成一系列具有TMB催化活性的聚鳥嘌呤納米線（G-wire）。我們將此現(xiàn)象作為信號放大方式應(yīng)用于金電極上靈敏檢測DNA片段。把巰基修飾的c-myc序列連接在金電極上，加入游離的c-myc序列和鎂離子，利

10、用計時電流法和電化學阻抗法均檢測到TMB催化信號的增強。隨后，利用目標DNA打開發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針，使c-myc序列暴露，形成G-wire后進行信號放大檢測，最低可檢出15 pM。此方法不需要生物酶的參與，避免了復雜的溫控過程，可以在室溫下進行。與其他方法相比，該方法在靈敏度、線性范圍上具有優(yōu)點，有望滿足基本的復雜樣品檢測需求。
　　5.基于聚鳥嘌呤納米線信號放大靈敏檢測凝血酶
　　凝血酶的活性及含量可以作為衡量凝血機制的關(guān)鍵指標

11、之一，它對相關(guān)疾病的早期診斷、治療及愈后判斷具有非常重大的意義。建立快速、準確、簡便、高靈敏的分析檢測策略和傳感裝置用于凝血酶的定量分析在化學、生物、醫(yī)學等領(lǐng)域中十分必要。本章以聚鳥嘌呤納米線為信號放大結(jié)構(gòu)構(gòu)筑了免標記型的電化學傳感器用于靈敏檢測凝血酶。目標蛋白凝血酶可以與電極上的適配體和溶液中的L-DNA同時結(jié)合形成夾心結(jié)構(gòu)，將L-DNA組裝到電極上，在游離的c-myc和鎂離子的存在下引發(fā)G-wire的生成。在測試底液TMB和H2O2

12、中，聚鳥嘌呤納米線與hemin結(jié)合形成具有TMB催化功能的DNA酶串聯(lián)體，對TMB的催化反應(yīng)電流起到了明顯的增強作用，從而有效地提高了電極靈敏度。實驗結(jié)果表明，該電化學適體傳感器制備方法簡單、穩(wěn)定性好、具有較高的選擇性和靈敏度，將其用于臨床模擬樣品的分析檢測得到了令人滿意的結(jié)果。
　　6.聚腎上腺素熒光有機量子點的合成及其重金屬離子檢測應(yīng)用
　　熒光有機納米材料因具有低毒、較好的生物相容性、功能性可調(diào)等優(yōu)點，被認為在生物成像