白蟻纖維素酶的分離純化及性質(zhì)研究.pdf

1、本研究以廈門樹白蟻為材料，經(jīng)PBS緩沖液(pH6.7)勻漿抽提處理、硫酸銨分級(jí)分離獲得白蟻纖維素酶(Endo-1，4-β-D-Glucanase，EC3.2.1.4，簡稱EGase)粗酶。進(jìn)一步經(jīng)DEAE-Sepharose FastFlow陰離子交換柱層析、Shephadex G-100凝膠過濾柱層析等純化，得到比活力為458.7 U/mg的電泳單一純的酶制劑，測(cè)定該酶的分子量約為44.8kD，等電點(diǎn)(pI)為6.1，酶的紫外吸收峰在

2、278 nm，熒光發(fā)射峰在334nm。 ⑴該酶水解羧甲基纖維素鈉的最適pH值為5.0，最適溫度40℃，米氏常數(shù)Km值為7.197mg/ml，Vm為0.774．mmol/(Lmin)(pH5.0，40℃)。酶的熱穩(wěn)定性研究表明：該酶在pH4.6～9.0和在溫度低于45℃下穩(wěn)定。 ⑵化學(xué)修飾劑：溴代乙酸(BrAc)、N-溴代丁二酰亞胺(NBS)、碳化二亞胺、醋酸酐、對(duì)氯汞苯甲酸(pCMB)、巰基乙醇(MT)、乙酰丙酮、過

3、氧化氫(H2O2)、苯甲基磺酰氟(PMSF)，對(duì)酶修飾研究結(jié)果表明：瞇唑基、吲哚基、羧基和氨基是該酶的活性功能基團(tuán)，而蛋白質(zhì)分子中巰基、二硫鍵、胍基、硫醚基和羥基與酶活力無關(guān)。溴代乙酸(BrAc)，NBS，醋酸酐的抑制機(jī)理表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性類型抑制常數(shù)分別為42.8mmol/L、83.1mmol/L和16.5 mmol/L。 ⑶金屬離子對(duì)酶活力的影響：結(jié)果表明鹵素陰離子(Cl-，Br-，r-)，堿金屬離子(Li+，Na+，K+)對(duì)

4、酶活力也沒有影響。Ca2+，Zn2+，Mn2+對(duì)EGase具有明顯的激活作用，重金屬離子Cu2+，pb2+，Hg2+對(duì)酶具有不可逆抑制作用。 ⑷有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響：甲醇、乙醇和丙醇這三種一元醇對(duì)酶均表現(xiàn)為抑制的作用，抑制強(qiáng)度依次是甲醇＞丙醇＞乙醇。乙二醇、丙二醇和丙三醇對(duì)酶也都具有強(qiáng)烈的抑制作用，其半抑制濃度(IC50)分別為3.8％、14.5％和16.2％。其中乙二醇的抑制作用是可逆過程，其抑制常數(shù)(KI)為3.8％。苯